趙 珊， 呂雯婷， 劉 杰， 宋亮麗， 張海峰， 孫小琴， 顏其貴,2*

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 雅安 625014；2.四川農業(yè)大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

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1株大熊貓腸道纖維素降解菌的分離鑒定及其酶學性質

趙 珊1， 呂雯婷1， 劉 杰1， 宋亮麗1， 張海峰1， 孫小琴1， 顏其貴1,2*

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 雅安 625014；2.四川農業(yè)大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，利用剛果紅染色法，從大熊貓糞便內篩選具有降解纖維素能力的菌株，并研究其酶學特性。分離獲得1株酶活力較高的菌株A1，通過形態(tài)學和BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定儀鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)。菌株A1最適生長條件和酶活力測定表明，其最適生長溫度為37 ℃，NaCl濃度為0.5%，pH值為7.0，內切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和總酶活的最大值分別為0.139、0.074、0.126、0.108 5 IU/mL。豐富了大熊貓腸道纖維素降解菌的種類，為后續(xù)研究大熊貓如何消化利用竹纖維提供了菌源。

大熊貓；纖維素降解菌；蠟樣芽胞桿菌

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是我國特有的珍稀野生動物，1984年被列入世界10種瀕危物種之一。10月齡左右的亞成年體大熊貓，食性開始由母乳等高蛋白食物逐漸轉變?yōu)橐灾褡訛橹魇车母呃w維食物[1]。成年后，每只大熊貓平均每天攝取竹類物質高達12.5 kg[2]，大熊貓除了能消化利用竹子中的營養(yǎng)物質外，還能利用其中8%的纖維素及27%的半纖維素[3]。大熊貓基因組序列顯示[4]，大熊貓具有食肉類消化系統的相關消化酶類基因，但并沒有相關纖維素酶類的基因。朱立峰等[5]通過宏基因組學研究，發(fā)現大熊貓腸道菌群的纖維素酶及半纖維素酶相關基因。大熊貓腸道內的共生細菌幫助其消化利用竹纖維并參與重要營養(yǎng)物質的代謝。大熊貓的消化系統與食肉類相似，腸道分為小腸和大腸，沒有盲腸，腸道短，含氧量較高，所以推測大熊貓腸道更適合需氧或兼性厭氧的細菌生長。目前國內外對大熊貓腸道菌群的研究多集中于致病菌方面[6-7]，對大熊貓腸道纖維素降解菌的研究較少。本實驗從四川臥龍自然保護區(qū)的新鮮大熊貓糞便中分離鑒定出1株酶活較高的好氧纖維素降解菌A1，并對其生長條件及產酶性質進行了初步研究，為后續(xù)研究大熊貓腸道菌群及纖維素的有效利用提供一些基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集自四川臥龍自然保護區(qū)的10份健康大熊貓的新鮮糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①選擇培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10.0 g，胰蛋白胨2.5 g，酵母浸出物0.5 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，MgSO40.2 g，(NH4)2SO41 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；②擴大培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10.0 g，胰蛋白胨2.5 g，酵母浸出物0.5 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，MgSO40.2 g，(NH4)2SO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；③產酶液體培養(yǎng)基：1 cm×6 cm新華牌濾紙條，胰蛋白胨2.5 g，酵母浸出物0.5 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，MgSO40.2 g，(NH4)2SO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 主要試劑及儀器 胰蛋白胨、酵母浸出物等試劑購自Sigma公司，其余試劑均為國產分析純；BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定儀購自美國BD公司，V-1100D型可見分光光度計購自上海美譜達儀器公司，Thermo 481型恒溫/制冷搖床購自THERMO FORMA公司。

1.2 方法

1.2.1 纖維素降解菌的篩選 無菌條件下從糞便樣品內部取5 g樣品，用無菌生理鹽水進行系列稀釋。用L棒將200 μL稀釋后的樣品液均勻涂布于CMC-Na選擇培養(yǎng)基上，有氧條件下37 ℃培養(yǎng)48 h。菌落長出后，用1 mg/mL的剛果紅染液對平板染色15 min，然后用1 mol/mL NaCl脫色15 min，挑選菌落周圍有明顯水解圈的單個菌落在CMC-Na平板上反復劃線純化培養(yǎng)，保存菌種備用[8]。用無菌牙簽挑取各樣品平板上的單菌落點種到含1 mg/mL剛果紅的CMC-Na選擇培養(yǎng)基上，待菌落長出后，測量各菌株的菌落直徑C(cm)和水解圈直徑H(cm)，每株菌株設置3個平行試驗組。根據H/C值選出酶活較強的菌株[9]。

1.2.2 纖維素降解菌的形態(tài)觀察 對細菌進行革蘭染色后，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)。

1.2.3 纖維素降解菌的鑒定 依照國家標準GB/T 4789.14-2003，針對革蘭染色結果，利用BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定儀對篩選出的纖維素降解菌進行鑒定[10]。

1.2.4 菌株擴大培養(yǎng) 用接種環(huán)取A1單個菌落1環(huán)，接種于盛有50 mL CMC-Na擴大培養(yǎng)基的250 mL血清瓶中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)30～48 h。

1.2.5 菌株A1最適生長條件的研究 ①培養(yǎng)基起始pH值對菌株生長的影響：按4%的接種量將發(fā)酵液分別接種于pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的50 mL CMC-Na擴大培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，分別取樣測OD600值；②培養(yǎng)基起始NaCl濃度對菌株生長的影響：按4%的接種量將發(fā)酵液分別接種于NaCl濃度為0%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、8.0%和11.0%的50 mL CMC-Na擴大培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，分別取樣測OD600值；③不同培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響：按4%接種量接種后的CMC-Na擴大培養(yǎng)基，于5、20、30、37、50 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h，分別取樣測OD600值；④培養(yǎng)時間對菌株生長的影響：以優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對菌株進行連續(xù)培養(yǎng)120 h，每隔12 h取樣測定發(fā)酵液OD600值。

1.2.6 菌株A1纖維素酶活性的測定 繪制DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑測還原糖量的葡萄糖標準曲線[11]。以優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對菌株A1進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)6、12、24、36、48、60、72、84、96、120 h后分別取樣，將發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min后收集上清液，即得粗酶液[12]。分別取1 mL粗酶液加入以1% (質量與體積比) CMC-Na、1%微晶纖維素、1%水楊苷、50 mg濾紙為底物的1.5 mL檸檬酸緩沖液中，于37 ℃下反應1 h(測外切酶和總酶活時反應2 h)，加2 mL DNS試劑，煮沸5 min，冷卻定容至25 mL，以失活酶為對照組調零，在540 nm波長下測定吸光值。利用葡萄糖標準曲線，分別計算出內切葡聚糖苷酶(EG)、外切葡聚糖苷酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(BG)和總纖維素酶活力(FPA)[13-15]。酶活力單位定義：每分鐘降解底物釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(IU)。

1.2.7 濾紙降解率的測定 用以濾紙為唯一碳源的產酶液體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)A1菌株7、14、28 d，準確稱量降解前后的濾紙條干重，利用差重法計算濾紙降解率[16]。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

經過反復純化篩選，在有氧條件下獲得3株水解圈較明顯的菌株A1、A2和A3，3株菌株的H(cm)/C(cm)值見表1，以H/C值最大的A1作為后續(xù)研究菌種，A1水解圈照片見圖1。

表1 纖維素降解菌株的剛果紅染色結果

圖1 菌株A1的水解圈照片Fig.1 The Hydrolysis circle photo of strain A1

2.2 菌株A1的形態(tài)觀察

菌株A1培養(yǎng)48 h后，菌落近似圓形，扁平，乳白色且表面較粗糙。革蘭染色為陽性，菌體呈長桿狀，中生圓柱形芽胞。菌體形態(tài)見圖2。

圖2 菌株A1的顯微形態(tài)Fig.2 The microcosmic modality of strains A1

2.3 菌株A1的鑒定

BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定儀鑒定菌株A1為蠟樣芽胞桿菌，生理生化試驗結果見表2。

表2 菌株A1生理生化試驗結果

注：“+”陽性; “-”陰性;“ND”:無數據

2.4 菌株A1的最適生長條件

各因素對菌株A1生長的影響見圖3。由圖3可知，12～24 h為菌株A1的生長調整期，24 h后進入生長指數期，72 h達到峰值，72 h后為衰亡期。培養(yǎng)基初始pH值對菌株A1生長的影響較大，當pH值為7.0時菌株A1生長最好，pH值為6.0～9.0時生長較好，說明菌株A1對堿性環(huán)境有一定的耐受性。設置不同NaCl濃度的發(fā)酵液培養(yǎng)菌株，結果表明菌株A1在0.5% NaCl時生長最好，且隨著NaCl濃度增大，生長能力降低。不同細菌的生長需要不同的培養(yǎng)溫度，人們通過采集各種環(huán)境溫度的樣品以期獲得不同嗜溫性的細菌[17-18]。本研究中，菌株A1在37 ℃時生長最好，溫度高于45 ℃后菌株幾乎不生長。故后續(xù)研究菌株A1產纖維素酶活性時，培養(yǎng)基初始pH調為7.0，NaCl濃度調為0.5%，培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖3 各因素對菌株A1生長的影響Fig.3 Effect of various factors on the growth of strain A1

2.5 菌株A1的纖維素酶活性

纖維素的生物降解過程涉及到一組復合的纖維素酶，一般認為包括3種，分別為內切葡聚糖苷酶，簡稱內切酶；外切葡聚糖苷酶，簡稱外切酶；β-葡萄糖苷酶，也稱纖維二糖酶[19]。以濾紙為底物培養(yǎng)菌株A1，連續(xù)測定不同時間的纖維素酶總酶活和各組分酶活力，試驗結果見圖4。由圖4可知，菌株A1的纖維素酶系包括以上3種酶，培養(yǎng)48 h后外切葡聚糖苷酶活性(CBH)和濾紙酶活性(FPA)達到最大值，分別為0.074、0.108 5 IU/mL；培養(yǎng)60 h后β-葡萄糖苷酶活性(BG)達到最大值為0.126 IU/mL；培養(yǎng)72 h后內切葡聚糖苷酶活性(EG)達到最大值為0.139 IU/mL。各組分酶達到最大值的時間均在細菌生長指數期內(見圖3)，表明細菌生長較快，代謝活動旺盛，產胞外纖維素酶的活性也較強。4條纖維素酶活力變化曲線走向非常相似，很好地表明了纖維素復合酶系的協同作用[20]。

2.6 菌株A1的濾紙降解率

濾紙降解率試驗結果見圖5，菌株A1對濾紙有一定的降解能力，但其降解率并不高[21]。

圖4 菌株A1產纖維素酶活力變化曲線Fig.4 Cellulase production changes of strains A1

圖5 菌株A1濾紙降解率試驗結果Fig.5 The result of filter paper degradation rate test of strain A1

3 討 論

大熊貓如何消化和利用竹纖維一直都是研究的熱點。本研究利用篩選培養(yǎng)基，從大熊貓的新鮮糞便中成功篩選出1株酶活力較高的好氧纖維素降解菌A1，經BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定儀鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)。菌株A1能夠在pH范圍為6.0～9.0內生長(最適pH為7.0)，對堿性環(huán)境有一定的耐受能力；最適生長溫度為37 ℃，最適NaCl濃度為0.5%。與以往同類研究相比，本次實驗利用BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定儀準確且快速鑒定了菌種種類，同時首次分離出大熊貓腸道內具有降解纖維素能力的蠟樣芽胞桿菌。菌株A1具有完整的3種纖維素酶，以濾紙為碳源測定纖維素酶活力時，總酶活最大值為0.108 5 IU/mL，雖然與國內已有報道的高酶活蠟樣芽胞桿菌的酶活力相比還比較低[22]，但這也說明了大熊貓消化與利用竹纖維不只依賴細菌，還與胃內纖毛蟲有密切關系[23]。菌株A1的分離鑒定豐富了大熊貓腸道菌群種類，為以后研究大熊貓腸道內降解纖維素的機制提供了菌源。菌株A1對堿性環(huán)境有一定的耐受能力，后續(xù)研究中可以通過適當添加纖維素酶激活劑[24]或通過誘變、優(yōu)化培養(yǎng)條件和基因工程手段等提高產酶量，使其在實際生產中有更加廣闊的應用前景。

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Isolation of Cellulose Degradable-Bacteria from Giant Panda′s Intestines and Its enzymatic Characterization

ZHAO Shan1, LV Wen-ting1, LIU Jie1, SONG Liang-li1,ZHANG Hai-feng1, SUN Xiao-qin1, YAN Qi-gui1,2

(1.Coll.ofVet.Med., 2.KeyLab.ofAnimalDis. &HumanHealthofSichuanProv.,SichuanAgric.Uni.,Ya’an625014)

Using sodium carboxymethylcellulose as unique carbon source and Congo red staining method, cellulose degradable bacterial strains were isolated from giant panda′s fecal samples, and studied on their enzymatic characteristics. Strain A1 with high enzyme activity was isolated, it was identified asBacilluscereusmorphologically and through BD PhoenixTM-100 full-automatic bacteria identification instrument. Growth condition and enzymatic activity tests showed that the optimal growth temperature of the strain was 37 ℃. 0.5%NaCl and pH at 7.0 the maximum activity of endo-glucanase was at 0.139 IU/mL, exo-glucanase 0.074 IU/mL, beta-glucosidase 0.126 IU/mL and the total ernzymatic activity was 0.108 5 IU/mL respectively. This research enriched the species of cellulose degrading-bacteria in giant panda′s intestines and strain A1 provided strain source for the following up study on how the giant panda digest and utilize bamboo fiber.

giant panda; cellulose degradable bacteria;Bacilluscereus

國家級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310626009)；四川省檢驗檢疫局課題(SK201305)

趙珊 女，本科。研究方向為微生物及免疫。E-mail:zhaoshan419@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導師。研究方向為動物傳染病病原分子生物學。E-mail:yanqigui@126.com

2014-04-02；

2014-04-25

Q93；Q781

A

1005-7021(2015)01-0073-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.014