1株三乙胺高效降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究

蘇建文， 許尚營， 陳建華， 時(shí)永輝， 王俊超， 王彩冬， 鄭 浩， 賈秀粉

(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400)

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1株三乙胺高效降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究

蘇建文， 許尚營*， 陳建華， 時(shí)永輝， 王俊超， 王彩冬， 鄭 浩， 賈秀粉

(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400)

從山東某制藥廠污水處理系統(tǒng)的活性污泥中馴化、篩選分離得到1株能夠以三乙胺作為唯一碳源、氮源和能源進(jìn)行生長的細(xì)菌，命名為T-5。根據(jù)菌落形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性對(duì)比分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌為需氧、革蘭陽性菌，氧化酶呈陽性反應(yīng)，吲哚試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)，不分解乳糖，且該菌的16S rDNA序列與蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)的相似度達(dá)99%，因此，初步鑒定該菌為蠟狀芽胞桿菌。通過搖瓶實(shí)驗(yàn)考察了溫度、pH、接種量對(duì)菌株T-5降解三乙胺性能的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌生長和降解三乙胺的最適培養(yǎng)條件為溫度30 ℃，pH 7.0。在最適培養(yǎng)條件下，T-5能夠在48 h內(nèi)將500 mg/L三乙胺完全降解。研究成果對(duì)高效處理環(huán)境中的三乙胺污染具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

三乙胺；菌株鑒定；蠟狀芽胞桿菌；降解性能

三乙胺是一種脂肪族胺，具有強(qiáng)烈的氨臭味、有刺激性，易燃，易揮發(fā)，在有機(jī)合成、農(nóng)藥、制藥、燃料等生產(chǎn)中被作為重要的溶劑和工業(yè)原料[1-2]。近年來工業(yè)上三乙胺廢水排放量日益增加，使得三乙胺污染日益嚴(yán)重。許多研究表明，三乙胺對(duì)動(dòng)物和人類有毒害作用，長期暴露于三乙胺中對(duì)腎、肝、肺和心血管系統(tǒng)均有損害[3]。因此，有效處理三乙胺廢水非常重要。目前，三乙胺廢水的處理方法主要為物理化學(xué)法，包括吸附法、氧化法、焚燒法和吸收法等[4-5]。然而，這些方法有許多缺點(diǎn)。相比之下，生物處理方法因其具有處理量大，成本低，條件溫和，不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，成為三乙胺廢水處理技術(shù)的研究熱點(diǎn)[6-9]。Wang Chun-Chin 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過馴化后污泥中的混合菌群能夠利用工業(yè)合成廢水中的三乙胺進(jìn)行生長繁殖。Rappert S. 等[11]從被污染的土壤中分離出2株三乙胺降解菌PseudomonascitronellolisRAl和MycobacteriumdienhoferiRA2，能夠利用三乙胺作為唯一碳源和能源生長。Cai Tianming等[12]自制藥廠活性污泥中分離得到1株細(xì)菌ArthrobacterprotophormiaeR4，該菌珠在濃度為100 mg/L的三乙胺溶液中培養(yǎng)32 h，能夠?qū)⑷野吠耆到?。國?nèi)有關(guān)純種微生物降解三乙胺的報(bào)道較少。本研究自山東某制藥廠污水的活性污泥中篩選得到1株能夠高效降解三乙胺的菌株BacilluscereusT-5，對(duì)其生長代謝及降解特性進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將對(duì)處理工業(yè)產(chǎn)生的三乙胺廢水提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基(g/L) ①三乙胺無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO40.09，K2HPO40.22，NaH2PO40.26，MgSO4·7H2O 0.23，CaCl20.28，F(xiàn)eCl30.003，三乙胺濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而定，pH約為7.0；②富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，pH約為7.5，121 ℃濕熱滅菌20 min；③牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.2～7.4，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與菌株的分離純化 樣品取自山東某制藥廠污水處理系統(tǒng)中的活性污泥。取10 mL活性污泥接種于含100 mg/L三乙胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，設(shè)定溫度30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)8 d。采用梯度壓力馴化法，每隔8 d以10%的接種量依次轉(zhuǎn)接到含有200、300、400和500 mg/L的三乙胺無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。前期馴化完成后，采用稀釋涂布平板法，在含有500 mg/L三乙胺的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上涂布，待菌體生長后，選擇生長良好，形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)接至含相同質(zhì)量濃度的三乙胺無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3次后，采用平板劃線法，在含有500 mg/L三乙胺的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上分別劃線，挑取單一菌落至富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)后再經(jīng)多次平板劃線，直至獲得單一菌落。將菌株接種于三乙胺無機(jī)鹽斜面培養(yǎng)基，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)菌生物學(xué)鑒定 ①菌株T-5的生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]對(duì)降解菌株進(jìn)行鑒定；②菌株T-5的16S rDNA擴(kuò)增及鑒定：菌株DNA的提取方法參照文獻(xiàn)[15]，PCR引物為通用引物F27(5′-AGAGTTTGATCATGTCTCAG-3′)和R1492(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL體系)：Templet(Genomic DNA)1 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，10×KOD Buffer 5 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L)1 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL，KOD DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 36 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 3 min；循環(huán)94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化后，由上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測定，獲得的序列提交至GenBank，通過BLAST程序與其他細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析。采用Clustal W軟件與Mega 4.1軟件中Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 菌株T-5的降解特性研究 將分離純化得到的菌株接種于富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h后收集菌體，無菌條件下用無菌水洗滌3次，用等體積的無機(jī)鹽培養(yǎng)基將菌體重懸，調(diào)菌懸液OD600至1.0，作為種子液備用。取新鮮種子液5 mL，接種于100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，分別考察在初始三乙胺濃度500 mg/L、轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min條件下，不同接種量、溫度和pH對(duì)菌株生長和三乙胺降解的影響。

1.2.4 菌株T-5對(duì)三乙胺廢水的處理 三乙胺廢水取自山東某制藥廠，廢水中三乙胺質(zhì)量濃度為68 316 mg/L，將該廢水稀釋至三乙胺質(zhì)量濃度為500 mg/L作為實(shí)驗(yàn)原水。取實(shí)驗(yàn)原水200 mL于500 mL的錐形瓶內(nèi)，按5%的接種量將T-5種子液接種至錐形瓶內(nèi)，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，并檢測三乙胺濃度。

1.2.5 分析方法 ①三乙胺含量的測定：樣品經(jīng)0.22 μm過濾后，堿性條件下利用二氯甲烷萃取，釆用氣相色譜法測定[16-17]；②菌體生長量的測定：細(xì)菌的生長量通過分光光度法測定，以波長600 nm處的光密度(OD600)表示；③氨氮濃度的測定：樣品經(jīng)0.22 μm過濾后，采用納氏試劑法測定[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征

通過富集培養(yǎng)從山東某制藥廠污水處理系統(tǒng)的活性污泥樣品中分離得到1株細(xì)菌T-5，該菌能以三乙胺作為唯一碳源、氮源和能源，在質(zhì)量濃度為500 mg/L三乙胺的無機(jī)培養(yǎng)基中生長良好。菌株T-5在LB平板上培養(yǎng)，形成的菌落較大，圓形，灰白色，不透明，表面粗糙(似毛玻璃狀)，邊緣呈擴(kuò)散狀。生理生化測試發(fā)現(xiàn)，菌株T-5為需氧革蘭陽性菌，氧化酶呈陽性反應(yīng)，吲哚試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)，不分解乳糖，吲哚反應(yīng)、MR反應(yīng)均呈陰性，能夠發(fā)酵多種糖類(表1)。

2.2 菌株T-5的16S rDNA分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

提取菌株T-5的基因組DNA，利用通用引物擴(kuò)增得到16S rDNA，如圖1所示。經(jīng)測序得到的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的多種芽胞桿菌相似度達(dá)99%以上。GenBank登錄號(hào)為KF 877717。圖2為菌株T-5的系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株T-5與BacilluscereusATCC14579(NR 074540)的進(jìn)化距離最近。結(jié)合T-5的形態(tài)及生理生化特性實(shí)驗(yàn)，鑒定該菌為蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)。

表1 T-5的生理生化特性

注：“+”為陽性反應(yīng)；“-”為陰性反應(yīng)

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖像Fig.1 Agarosegle electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA

2.3 菌株T-5的生長及對(duì)三乙胺的降解特性研究

將T-5的新鮮種子液以5%的接種量接種于質(zhì)量濃度為500 mg/L的三乙胺的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間檢測三乙胺、氨氮的質(zhì)量濃度和OD600(圖3)。由圖3可知，最初16 h內(nèi)T-5處于生長的延滯期，菌體生長緩慢，三乙胺的降解速率很低；16～40 h時(shí)，T-5處于對(duì)數(shù)生長期，菌體增殖迅速，生長量明顯增加，三乙胺降解速率最快，降解率高達(dá)92.5%；40 h后菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定階段，最大菌體光密度達(dá)到0.294。此外，隨著三乙胺的降解，培養(yǎng)基中的氨氮質(zhì)量濃度逐漸上升，最終達(dá)到58.3 mg/L，達(dá)到理論釋放值的85%。

圖2 菌株T-5系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain T-5

圖3 菌株T-5生長曲線和三乙胺降解曲線Fig.3 Growth curve of strain T-5 and degradation curve of triethylamine

2.4 不同因素對(duì)三乙胺降解的影響

2.4.1 接種量對(duì)菌株T-5降解三乙胺的影響 按0.5%、1%、3%、5%和10%的接種量將T-5種子液接種于質(zhì)量濃度為500 mg/L的三乙胺的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)64 h。每隔8 h測定三乙胺質(zhì)量濃度。接種量表明了菌體量和底物量之間的比例關(guān)系，體現(xiàn)了底物和微生物之間的相互影響，接種量對(duì)T-5降解三乙胺的影響如圖4所示。

圖4 接種量對(duì)菌株T-5降解三乙胺的影響Fig.4 Effect of inoculation on triethylamine degradation of strain T-5

接種量由0.5%增至5%時(shí)，隨著接種量的增加，三乙胺的降解效果也不斷增強(qiáng)。當(dāng)接種量繼續(xù)增加至10%時(shí)，三乙胺的去除效果變化并不明顯。其原因可能是當(dāng)接種量較少時(shí)，底物濃度相對(duì)較高，從而使細(xì)菌長期處于生長延滯期，導(dǎo)致三乙胺去除率不高。當(dāng)提高接種量時(shí)，能增加菌體濃度，使得延滯期縮短。但接種量過大時(shí)，由于受培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)限制，菌體的數(shù)量會(huì)達(dá)到飽和，致使菌體對(duì)三乙胺的降解效率提高不明顯。

2.4.2 溫度對(duì)菌株T-5降解三乙胺的影響 將T-5種子液按5%的接種量接種于質(zhì)量濃度為500 mg/L的三乙胺的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，pH 7.0、150 r/min條件下，分別在20、25、30、35、40和45 ℃連續(xù)振蕩培養(yǎng)64 h，測定三乙胺質(zhì)量濃度。

圖5 溫度對(duì)菌株T-5降解三乙胺的影響Fig.5 Effect of temperature on triethylamine degradation of strain T-5

由圖5可知，溫度對(duì)三乙胺的去除有顯著的影響，溫度由20 ℃升高至30 ℃過程中，三乙胺的去除率顯著提高，在30 ℃時(shí)降解效果最佳，去除率為100%。然而，當(dāng)溫度超過40 ℃時(shí)，三乙胺的降解效果明顯下降，45 ℃時(shí)三乙胺的降解率最低，這是因?yàn)楦邷刂率勾x過程所需的酶變性或失活，導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)對(duì)三乙胺的降解。因此，該菌最適降解溫度為30 ℃。

2.4.3 pH對(duì)菌株T-5降解三乙胺的影響 以5%的接種量將T-5種子液接種于質(zhì)量濃度為100 mL的三乙胺的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下，利用2 mol/L的HCl將培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，連續(xù)振蕩培養(yǎng)64 h。每隔8 h測定三乙胺濃度。由圖6可知，在不同的pH條件下，菌株T-5對(duì)三乙胺均有降解作用，但降解率不同。當(dāng)pH小于7.0時(shí)，隨著pH增加三乙胺的去除率明顯提高；而當(dāng)pH大于7.0時(shí)，三乙胺的去除效果開始下降；pH為7.0時(shí)，三乙胺降解率最高，達(dá)到99.5%。結(jié)果表明酸性條件更利于三乙胺的去除。這是由于三乙胺代謝的最終產(chǎn)物為NH3，當(dāng)初始pH過高時(shí)會(huì)使培養(yǎng)基中游離NH3濃度增加，導(dǎo)致微生物出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，降低三乙胺的降解效率；反之，初始pH較低時(shí)，酸性環(huán)境可以減弱自身代謝產(chǎn)物的影響，使得三乙胺降解率提高。但是，初始pH為5.0時(shí)，由于酸性環(huán)境影響微生物的正常生理活動(dòng)，使菌體受到酸性侵害，導(dǎo)致降解率下降。

圖6 pH對(duì)菌株T-5降解三乙胺的影響Fig.6 Effect of pH on triethylamine degradation of strain T-5

2.5 菌株T-5對(duì)三乙胺廢水的處理效果

為考察菌株T-5對(duì)含三乙胺化學(xué)合成制藥廢水的處理效果，將10 mL新鮮T-5種子液接種于200 mL稀釋后的三乙胺廢水中，于30 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，并設(shè)置對(duì)照組(不接種T-5，其他條件同實(shí)驗(yàn)組)。利用氣相色譜檢測三乙胺去除效果，結(jié)果見圖7。由圖7可見，實(shí)驗(yàn)組中菌株T-5在48 h內(nèi)將質(zhì)量濃度為500 mg/L的三乙胺完全降解。與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組中三乙胺質(zhì)量濃度僅有少量降低。這說明該菌株能夠在某些含三乙胺的生產(chǎn)廢水中生長繁殖，并有效地去除三乙胺。因此，該菌株具有很好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖7 降解48 h后三乙胺的GC檢測Fig.7 GC detection of triethylamine after biodegradation by 48 h

3 討 論

Bacilluscereus是一類需氧型的革蘭陽性細(xì)菌，廣泛存在于自然界中，能夠降解多種有機(jī)污染物，如苯胺、草甘膦、氯氰菊酯等，在自然環(huán)境的生物修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。本研究自山東某制藥廠污水處理系統(tǒng)的活性污泥中馴化、篩選分離得到1株高效三乙胺降解菌，命名為T-5。該菌能以三乙胺作為唯一碳源、氮源及能源。將該菌株的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫上比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與多種芽胞桿菌的相似度達(dá)99%，同時(shí)結(jié)合菌體的形態(tài)觀察、生理生化特性，鑒定該菌為蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)。降解性能實(shí)驗(yàn)表明：菌株T-5的最佳降解條件是接種量為5%，pH 7.0，溫度為30 ℃。最佳降解環(huán)境下對(duì)質(zhì)量濃度為500 mg/L的三乙胺在48 h內(nèi)降解率達(dá)到100%。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了該菌屬的菌株能夠降解三乙胺，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。在目前的研究報(bào)道中，菌株P(guān)seudomonascitronellolisRA1和MycobacteriumdienhoferiRA2需要4 d才能夠降解初始質(zhì)量濃度為200 mg/L的三乙胺。菌株ArthrobacterprotophormiaeR4在32 h內(nèi)僅能降解質(zhì)量濃度為100 mg/L的三乙胺。相比之下，菌株T-5在48 h內(nèi)能夠完全降解質(zhì)量濃度為500 mg/L的三乙胺，具有更高的耐受性和降解速率，具有明顯的優(yōu)勢。

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Screening and Identification of Triethylamine-Degradable Bacteria and Its Biodegradation Characteristics

SU Jian-wen, XU Shang-ying, CHEN Jian-hua, SHI Yong-hui,WANG Jun-chao, WANG Cai-dong, ZHENG Hao, JIA Xiu-fen

(ShandongNewTimePharm.Co.,Ltd.,Linyi273400)

A bacteria strain named as T-5 that could grow utilizing triethylamine as sole carbon source, nitrogen source, and energy was tamed and isolated from activated sludge in wastewater treatment pool in a pharmaceutical plant Shandong Province. It was an aerobic, Gram-positive, oxidase reaction positive, indole test reaction positive, lactose indecomposable, similarity of its 16S rDNA withBacilluscereuswas 99%, therefore, it was initially identified asBacilluscereusbased on 16S rRNA gene sequence analysis, homology comparison and analysis, morphological, and physiological properties. The pH, temperature and inoculation for the growth of T-5 were observed in shaker flash for the effect of its triethylamine degradable performance, the results showed that the optimal conditions were pH 7.0, 30 ℃, and 5%, respectively. T-5 was able to completely degrade 500 mg/L triethylamine within 48 hours under the optimal degradable conditions. This research achievement has very important application value for efficient treatment of triethylamine pollution in the environment.

triethylamine; identification;Bacilluscereus; degradation performance

蘇建文 男，工程師。主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù)。Tel：0539-5030891，E-mail：suda1999@163.com

* 通訊作者。男，工程師。研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。Tel：0539-5030891，E-mail：xushangying@126.com

2014-05-04；

2014-08-29

Q939.99； X172

A

1005-7021(2015)01-0054-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.011