向 宇，李宗明，李佳萍，劉國(guó)平，李長(zhǎng)春，李新云，趙書紅

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

恩施黑豬血液指標(biāo)測(cè)定分析及和CXCR4基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析

向 宇1，李宗明2，李佳萍1，劉國(guó)平2，李長(zhǎng)春1，李新云1，趙書紅1

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

為了解探究恩施黑豬這一地方豬種的免疫特性，采集了湖北某豬場(chǎng)的218頭免疫系統(tǒng)成熟的純種恩施黑豬，測(cè)定了24項(xiàng)血液五分類指標(biāo)并與農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)其他中外豬種的血液參數(shù)值進(jìn)行了分析比較；對(duì)免疫候選基因CXCR4進(jìn)行了多態(tài)性分析并發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)g542.C＞T和部分血液指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，為恩施黑豬的抗病育種提供了潛在的分子標(biāo)記。

恩施黑豬；血液指標(biāo)；CXCR4；關(guān)聯(lián)分析；分子標(biāo)記

恩施黑豬是原產(chǎn)自湖北省西南部恩施自治州的地方優(yōu)良豬種，具有良好的抗逆性和抗病力。目前對(duì)于恩施黑豬這一地方豬種的血液指標(biāo)研究不多，大部分集中在對(duì)其生產(chǎn)性能和胴體品質(zhì)等方面的開(kāi)發(fā)利用，尚未見(jiàn)對(duì)其免疫候選基因分子標(biāo)記的發(fā)掘。本試驗(yàn)希望通過(guò)對(duì)黑豬血液指標(biāo)的測(cè)定和分析，結(jié)合免疫候選基因SNP位點(diǎn)的篩選，為恩施黑豬的選育提供支持。

1??材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料樣品來(lái)自于湖北省某豬場(chǎng)的218頭純種恩施黑豬，按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，日齡在五月齡以上，免疫系統(tǒng)均已成熟且健康狀況良好，執(zhí)行統(tǒng)一的免疫程序，健康狀況良好。

1.2 血液采集和血液指標(biāo)的測(cè)定

用繩套或保定器套住恩施黑豬上頜部，自然保定，將一次性靜脈采血針穿刺針頭插入黑豬耳靜脈，通過(guò)透明硅膠軟管將另一頭接入帶抗凝劑EDTANa2的真空負(fù)壓抗凝管中，待血液至5 mL刻度處拔出穿刺針頭，待軟管內(nèi)血液流入負(fù)壓管內(nèi)拔出管塞穿刺針頭，輕微顛倒試管以便血液和抗凝劑重復(fù)混勻，放置于4 ℃短暫保存。

4 h內(nèi)將血樣用BC-5800全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血液五分類檢測(cè)，上機(jī)檢測(cè)前需再次搖勻。采血時(shí)間統(tǒng)一在涼爽的早晨豬只尚未進(jìn)食之前，便于減少豬只應(yīng)激和保持血液指標(biāo)的穩(wěn)定。

血液五分類檢測(cè)的數(shù)據(jù)包括24項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)：白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、血紅蛋白(HGB)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、血小板壓積(PCT)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、大型血小板比率(P-LCR)、中性細(xì)胞比率(NEUT%)、淋巴細(xì)胞比率(LYMPH%)、單核細(xì)胞比率(MONO%)、嗜酸性粒細(xì)胞比率(EO%)、嗜堿性粒細(xì)胞比率(BASO%)、中性細(xì)胞數(shù)(NEUT#)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYMPH#)、單核細(xì)胞數(shù)(MONO#)、嗜酸性細(xì)胞數(shù)(EO#)、嗜堿性細(xì)胞數(shù)(BASO#)。

1.3 數(shù)據(jù)分析比較

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有血液指標(biāo)，計(jì)算血液指標(biāo)的平均值、中值、標(biāo)準(zhǔn)差，與中國(guó)其他地方豬種及外來(lái)引進(jìn)豬種的相同血液指標(biāo)進(jìn)行分析比較。其他中外豬種的血液指標(biāo)來(lái)自文獻(xiàn)報(bào)道：杜洛克、大白豬、二花臉[1]、通城豬[2]。

1.4 DNA提取，CXCR4基因擴(kuò)增和表型關(guān)聯(lián)分析

保定恩施黑豬，讀取耳號(hào)或耳牌記錄個(gè)體信息，用耳號(hào)鉗夾取恩施黑豬耳組織，剪下的耳組織樣用鑷子裝入2 mL EP管中，采用天根生化科技有限公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（離心柱型），按照說(shuō)明書步驟提取。提取DNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和濃度測(cè)定。

根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室前期工作，用Primer 5設(shè)計(jì)了CXCR4基因外顯子區(qū)域的3對(duì)引物送上海生工公司合成，引物信息如表1所示。

PCR反應(yīng)體系為總體系10 μL，包括PCR Mix 5 μL，正向引物和反向引物各0.3 μL，DNA模板1 μL（50 ng/μL），ddH2O 3.4 μL。

PCR反應(yīng)過(guò)程為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度（52～57 ℃）40 s，72 ℃延伸40 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃5 min，低溫4 ℃保存。

2??結(jié)果

2.1 恩施黑豬血液五分類指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

恩施黑豬血液五分類指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表2所示。之前相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)的地方豬種的血液五分類指標(biāo)，白細(xì)胞數(shù)（WBC）參考范圍為10.73～33.13，紅細(xì)胞（RBC）參考范圍為5.15～8.12，血紅蛋白（HGB）參考范圍為96.03～177.52，血小板（PLT）參考范圍為172.61～443.88[3-5]。本次五分類測(cè)定的平均結(jié)果基本處于參考范圍之內(nèi)，但部分極值超出了參考范圍。

2.2 恩施黑豬血液指標(biāo)相關(guān)分析結(jié)果

對(duì)恩施黑豬血液指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果如圖1所示。白細(xì)胞五分類中每類型的細(xì)胞即淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的數(shù)目與自身細(xì)胞比率存在極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)分別為0.691，0.839，0.903，0.769和0.929。白細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞比率、嗜酸性粒細(xì)胞比率、嗜堿性粒細(xì)胞比率、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白量濃度均存在顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而和中性粒細(xì)胞比率、中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05）。淋巴細(xì)胞比率和中性粒細(xì)胞比率存在顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.7，中性粒細(xì)胞比率和其他幾種白細(xì)胞比率同樣存在顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。此外紅細(xì)胞和血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積間存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05），血紅蛋白與紅細(xì)胞壓積間也存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05）；平均血紅蛋白量和紅細(xì)胞平均體積間同樣存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05），平均血小板體積和大型血小板比率間存在極顯著的正相關(guān)（P＜0.01）血小板分布寬度與血小板及血小板壓積存在顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表1 候選基因CXCR4引物信息

表2 恩施黑豬血液免疫指標(biāo)總體統(tǒng)計(jì)

圖1 血液指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)

2.3 恩施黑豬和其他豬種血液指標(biāo)比較結(jié)果

將恩施黑豬和其他中外豬種相同的血液指標(biāo)進(jìn)行方差分析，結(jié)果恩施黑豬在WBC、RBC、HCT、MCV、HGB、LYMPH%、LYMPH#指標(biāo)上均顯著高于大白豬群體和杜洛克群體，在MCH、MCHC、PLT、PCT指標(biāo)上顯著高于二花臉群體。在紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)目上與通城豬無(wú)顯著差異。

2.4 CXCR4基因SNP位點(diǎn)和血液指標(biāo)關(guān)聯(lián)結(jié)果

采集恩施黑豬耳樣提取DNA，隨機(jī)選取10個(gè)恩施黑豬基因組DNA混合成的DNA pool，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增PCR原液送公司測(cè)序，使用Seqman對(duì)峰圖進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CXCR4基因第2外顯子上發(fā)現(xiàn)一個(gè)g.542 C＞T的SNP位點(diǎn)。通過(guò)直接測(cè)序法進(jìn)行基因分型，將該位點(diǎn)分型結(jié)果和血液指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表所示。該位點(diǎn)和WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT顯 著 關(guān) 聯(lián)（P＜0.05）。 其 中CC基因型個(gè)體的WBC、NEUT%、NEUT#、PCT均值顯著高于其他型個(gè)體（P＜0.05），TC基因型個(gè)體的LYMPH%、LYMPH#、PLT、PCT均值顯著高于其他型個(gè)體（P＜0.05），MONO%、HGB均值顯著低于其他型個(gè)體。

表3 CXCR4基因SNPg.542C＞T與表型性狀的關(guān)聯(lián)

3??討論

血液指標(biāo)特別是五分類指標(biāo)能有效反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，從生理角度來(lái)說(shuō)，血紅蛋白本身是紅細(xì)胞中的唯一非膜蛋白，由尚未成熟的紅細(xì)胞核糖體產(chǎn)生，兩者在數(shù)量上呈現(xiàn)顯著相關(guān)性；本次五分類測(cè)定中，這兩者的均值處在參考范圍里的較高，白細(xì)胞和中性細(xì)胞數(shù)、中性細(xì)胞比率呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，可能是骨髓干細(xì)胞分化的白細(xì)胞中，中性粒細(xì)胞壽命最短，骨髓造血能力大部分用于中性粒細(xì)胞的供給，機(jī)體正常水平時(shí)中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)目變化趨勢(shì)呈現(xiàn)一致的一種體現(xiàn)[4]。和免疫功能有關(guān)的大部分細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞均存在不同程度的相關(guān)，表示機(jī)體的免疫系統(tǒng)是一個(gè)相互作用復(fù)雜的整體。在臨床上部分血液指標(biāo)的急劇升高或降低可以作為產(chǎn)生疾病的征兆，但仍需要具體的抗原檢測(cè)?？傊私庋褐笜?biāo)的正常范圍波動(dòng)和不同指標(biāo)間的相關(guān)性有利于我們把握畜群的健康狀態(tài)。

在中外豬種的血液指標(biāo)比較中發(fā)現(xiàn)，恩施黑豬與杜洛克、大白豬這類引入品種在多項(xiàng)指標(biāo)上均存在顯著差異，而與二花臉、通城豬這類中國(guó)地方豬種在紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)目上無(wú)顯著差異；這充分表明了中國(guó)地方豬種和國(guó)外引入品種在免疫性狀上的差異同樣體現(xiàn)在不同類型的血細(xì)胞數(shù)目上。之前有研究表明，中外豬種的免疫細(xì)胞數(shù)目存在顯著性差異，例如梅山豬和大白豬的單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞[5]。而中國(guó)地方豬種內(nèi)部血液指標(biāo)的差異則主要集中在血紅蛋白和紅細(xì)胞分布上，這可能與不同地方豬種分布的不同區(qū)域和環(huán)境有關(guān)，同時(shí)也要考慮個(gè)體和品種之間的差異對(duì)不同血液指標(biāo)的影響。

通過(guò)候選基因法發(fā)現(xiàn)了CXCR4基因第二外顯子上發(fā)現(xiàn)一個(gè)g.542 C＞T的SNP位點(diǎn)與WBC、LYMPH%、NEUT#、LYMPH#、HGB、PLT、PCT顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。CXCR4基因是趨化因子受體家族成員之一，趨化因子受體4又被稱為融合素、CD184。CXCR4的天然配體是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子CXCR12，兩者相互作用形成的CXCR4/SDF-1生物學(xué)軸在參與細(xì)胞遷移、胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移與增殖、免疫調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等眾多生理病理過(guò)程都有著重要的意義[6]。已有研究也證實(shí)在CXCR4基因缺失的小鼠體內(nèi)B細(xì)胞前體細(xì)胞減少，而在血液中卻明顯增加。骨髓內(nèi)顆粒細(xì)胞也減少，但在血液中未成熟顆粒細(xì)胞明顯增加[7]。同樣有研究表示，CXCR4基因的不同SNP單倍型和HIV病毒、霍金奇淋巴癌、白血病感染等血液疾病和腫瘤感染有顯著相關(guān)，而且影響了感染后的白細(xì)胞數(shù)目變化及白細(xì)胞遷移情況。

因此，發(fā)現(xiàn)的CXCR4基因該SNP位點(diǎn)可能用于探究血液指標(biāo)變化，作為恩施黑豬免疫候選分子標(biāo)記應(yīng)用于該品種的選育。

[1] 劉向東，樊斌，趙云霞，向安靜，朱猛進(jìn)，彭中鎮(zhèn)，趙書紅. 中國(guó)地方豬二花臉與國(guó)外品種仔豬血液參數(shù)差異比較分析.[J] 中國(guó)豬業(yè)，2013，S1：202-203.

[2] 劉榜，張慶德，李奎，樊斌，官紅平，彭中鎮(zhèn)，徐三平，杜亞球. 通城、瑞典長(zhǎng)白、英國(guó)大白及其三元雜種豬部分免疫性狀研究. [J] 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，07： 35-38.

[3] 趙拴平，王睿琪，唐中林，昝林森，李奎. 3個(gè)地方品種豬血液生化指標(biāo)分析. [J]中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39，2：96-99.

[4] 金伯泉. 細(xì)胞和分子免疫學(xué)[M]. 第2版.北京：科學(xué)出版社，2001.

[5] Clapperton M，Bishop SC，Glass EJ. Innate immune traits differ between Meishan and Large White pigs.[J] Veterinary immunology and immuno pathology.2005，104：131-144

[6] Kawabata K， Ujikawa M， Egawa T，et al.A cell-autonomous requirement for CXCR4 in long-term lymphoid and myeloid reconstitution.[J] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1999，96：5663-5667.

[7] 王宜青. SDF-1/CXCR4軸以及MCP-1/CCR2軸對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移及歸巢的影響[D]. 蘇州大學(xué)， 2014.

2015-06-23）

湖北省重大科技創(chuàng)新計(jì)劃產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（2014ABC012）、湖北省杰出青年基金（2014CFA024）和教育部科技學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（113048A）