復方中藥對大強度運動大鼠海馬NF-κB p65、TNF-α和IL-10表達的影響

劉顯斌1，吳春燕2

(1. 山東省水上運動管理中心，山東 日照276800；2. 山東省體育科學研究中心，山東 濟南250012)

摘要：目的研究復方中藥益氣養(yǎng)血補腎方對長期大強度運動大鼠海馬炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-10的影響，進一步探討該中藥的神經保護作用及機制。方法45只雄性SD大鼠隨機分為對照組、大強度運動組和中藥組，每組15只。其中，大強度運動組和中藥組進行遞增負荷跑臺訓練，時間為7周。用Western-blotting法測定海馬NF-κB p65的蛋白表達水平，用ELISA法觀察大鼠海馬TNF-α、IL-10蛋白表達水平。結果與對照組相比，大強度運動組NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)；中藥組NF-κB p65、TNF-α蛋白表達水平明顯低于大強度運動組(P<0.05，P<0.01)，IL-10蛋白表達水平則明顯高于大強度運動組(P<0.01)。結論：復方中藥益氣養(yǎng)血補腎方可能通過降低NF-κB p65、TNF-α表達水平抑制長期大強度運動引起的炎癥反應，并通過升高IL-10表達水平促進抗炎作用，減輕缺血缺氧性腦損傷，從而發(fā)揮神經保護作用。

關鍵詞：大強度運動；海馬；NF-κB p65，TNF-α，IL-10

中圖分類號：G804.7

收稿日期：2015-03-20

基金項目：國家體育總局重點研究領域攻關課題(編號：2014B058)。

作者簡介：劉顯斌(1971-)，男，高級教練員，研究方向運動訓練與體能康復。

Effects of compound Chinese medicine on the expression of NF-κB p65, TNF-α and IL-10 in Rat Hippocampus with high intensity exercise

LIU Xian-bin1, WU Chun-yan2

(1.ShandongWaterSportsManagementCenter,Rizhao276800,Shandong,China; 2.ShandongResearchCenterofSportsScience,Jinan250102,Shandong,China)

Abstract:Objective: To study the effects of compound Chinese medicine on the expression of NF-κB p65, TNF-α and IL-10 in rat hippocampus with long-term high intensity exercise.Methods: Male SD rats were randomly divided into three groups: control group (n=15), high intensity exercise group (n=15) and Chinese medicine group (n=15). The exercise project was applied by 7 weeks treadmill at progressive increase exercise intensity．The level of protein expression of NF-κB p65 in rat hippocampus was detected by the methods of Western blotting. The levels of protein expression of TNF-α, IL-10 were determined by the methods of ELISA.Results: Compared with the control group, the levels of protein expression of NF-κB p65, TNF-α, IL-10 in high intensity exercise group were obviously increased. The levels of protein expression of NF-κB p65 and TNF-α in Chinese medicine group were significantly decreased compared with those in high intensity exercise group. The levels of protein expression of IL-10 in Chinese medicine group were obviously increased compared with those in high intensity exercise group.Conclusions:The compound Chinese medicine can inhibit inflammatory by reducing the expression of NF-κB p65 and TNF-α, and promote anti-inflammatory by increasing the expression of IL-10, so as to protect the brain from ischemia injury probably.

Key words:high intensity exercise; Hippocampus; NF-κB p65；TNF-α；IL-10

已有研究證實，大強度運動可引起機體多種炎性因子水平的變化，因而引發(fā)一系列炎性反應[1-2]。NF-κB是近年發(fā)現的一種與炎癥反應密切相關的轉錄因子，在腦缺血性損傷后腦組織的炎癥反應中扮演重要角色[3]。腦組織缺血時，NF-κB被特異性激活，通過調控腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6 (IL-6)、白介素-1( IL-1)、、白介素-10 (IL-10)等多種細胞因子和炎癥介質的基因表達，參與缺血性腦損傷的病理生理過程。長期大強度運動可使機體腦部血流量下降，氧供相對不足，大量炎性細胞聚集，引發(fā)大量炎性介質和炎性細胞因子的釋放，出現缺血、缺氧性損傷，從而導致神經系統功能下降。

傳統的中醫(yī)藥在長期大強度運動導致的運動疲勞的消除方面具有獨特的優(yōu)勢。前期研究已經證實[4]，復方中藥益氣養(yǎng)血補腎方可以通過抗氧自由基，調節(jié)神經遞質水平，提高神經營養(yǎng)因子水平等發(fā)揮神經保護作用。本研究以炎癥反應為切入點，通過建立大強度運動模型，觀察長期大強度運動下大鼠海馬炎性因子NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達水平的變化，并用復方中藥益氣養(yǎng)血補腎方進行干預，從炎癥反應層面進一步探討其對運動疲勞的神經生物學機制。

1材料與方法

1.1動物分組

雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠45只，7周齡，清潔級，體重187.6±15.3g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為對照組、大強度運動組和中藥組，每組15只。

1.2運動模型的建立

對照組不進行任何運動訓練，大強度運動組和中藥組在小動物跑臺上進行跑臺訓練。采用的運動方案參考 Bedford[5]和 Wisloff[6]的遞增負荷跑臺運動(并略加修改)，時間為7周(具體方案見表1)。力竭標準為：大鼠不能保持預定速度，3次以上滯留于跑道后1/3處，刺激驅趕無效。行為特點表現為神精倦怠、呼吸深大，俯臥位，對刺激反應不明顯。

表1　動物訓練方案(m/min×min)

1.3藥物制備及給藥方法

中藥益氣養(yǎng)血補腎方組成：白術、熟地、人參、川芎、茯苓、甘草、白芍、當歸、補骨脂、杜仲各9g、川斷、山藥、牛膝各6g、肉桂3g(由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥房提供) ，將以上藥用蒸餾水浸泡30 min，煎煮兩次(30 min/次) ，過濾，合并濾液加熱蒸發(fā)濃縮，制成100%濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

中藥組每天給予益氣養(yǎng)血補腎方水煎劑0.1ml/10mg，于運動前半小時灌胃，對照組及大強度運動組給予同體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃7周。

1.4取材

最后一次訓練結束后24小時，將各組大鼠深度麻醉后快速斷頭，分離海馬，先置于液氮罐中速凍，后-70℃超低溫冰箱保存。

1.5儀器與試劑

1.5.1儀器

離心機(德國Eppendorf-5430)，低溫冰箱(日本三洋MDF-382E型)，移液器(德國EPPENDORF)，恒溫水浴箱(江蘇太倉醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型)，電子天平(德國Sartorius公司)，制冰機(德國AF10 SCOTSMAN)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.5.2試劑

NF-κB抗體(美國CST公司)，TNF-α、IL-10ELISA試劑盒，DAB顯色試劑盒。

1.6指標測試

1.6.1Western-blotting法檢測海馬NF-κB p65蛋白表達

從-70℃超低溫冰箱中每組取出5個海馬組織，加入適量裂解液后置于冰上進行勻漿； 12000轉離心10分鐘，取上清，考馬斯亮藍法測定蛋白含量并調平各組蛋白濃度；分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?；各樣本等量蛋白進行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉至PVDF膜；取出轉移膜置于封閉液中，室溫下振搖1小時，以封閉膜上的非特異結合；封閉后的膜加入稀釋的一抗工作液中，4℃ 反應過夜；TBST洗膜，10分鐘×3次；洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中，室溫、避光振搖60分鐘；將膜取出，TBST洗滌，10分鐘×3次；顯色，曝光，Image J軟件計算條帶灰度值，計算目的蛋白和β-actin的Optical Density (OD)比值。

1.6.2ELISA法測定TNF-α、IL-10的蛋白表達

將每組剩余的10個海馬組織勻漿離心后取上清液，采用ELISA法測定TNF-α、IL-10的水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.7數據統計與分析

用SPSS15.0軟件對數據進行數據處理，計數資料以x±s表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2結果

2.1各組大鼠海馬NF-κB p65的蛋白表達

對照組可見少量NF-κB p65表達，大強度運動NF-κB p65蛋白表達量較對照組顯著升高(P<0.01)，中藥組NF-κB p65蛋白表達量則明顯低于大強度運動組(P<0.01)(見圖1，2)。

A為對照組，B為大強度運動組，C為中藥組 圖1　各組大鼠海馬NF-κB p65蛋白表達變化 注：△△表示，與對照組相比，P<0.01；##表示，與大強度運動組相比，P<0.01。

圖2　各組大鼠海馬NF-κB p65蛋白表達特點

2.2各組大鼠海馬TNF-α、IL-10的蛋白表達

組別TNF-α(ng/L)IL-10(ng/L)對照組大強度運動組中藥組127.86±18.54185.41±21.33△△166.97±19.64#141.23±20.66225.71±30.69△△261.62±27.53##

注：△△表示，與對照組相比，P<0.01；#表示，與大強度運動組相比，P<0.05，##表示，與大強度運動組相比，P<0.01。

3討論

長期大強度運動作為一種對機體的過度應激，超出了機體生理機能所能承受的負荷，可對機體造成一定的損傷[7]。大強度運動引起的腦缺血缺氧性損傷可導致神經系統功能失調與障礙，是引發(fā)運動疲勞的可能機制之一。在眾多的腦缺血缺氧性損傷的病理機制中，炎性細胞因子的表達和炎性細胞的浸潤激活的炎癥反應可加重機體組織的損傷，促進繼發(fā)性腦損害發(fā)生，成為腦缺血再灌注損傷的重要組成部分和主要過程之一。

NF-κB是一種與炎癥反應密切相關的轉錄因子，NF-κB的激活是腦缺血性損傷后腦組織的炎癥反應的關鍵。NF-κB存在于腦血管內皮細胞、神經元和神經膠質細胞中，是NF-κB/Rel蛋白家族成員，由多肽p50和p65亞基形成p50-p65同源二聚體及p50-p65異源二聚體。其中發(fā)揮主要生理功能的是p50-p65異源二聚體。NF-κB未激活時與抑制蛋白IκB結合位于胞質，在某些刺激因素作用下IκB降解，并與 NF-κB解離后被激活，進入胞核與特定基因啟動子結合，調控基因的轉錄。多種炎癥遞質基因的啟動子和增強子中包含κB位點，如TNF-α、IL-1、IL-6等，這些因子促進炎癥反應，加重腦損傷，在缺血再灌注后所引發(fā)的繼發(fā)性損傷中起關鍵作用。

TNF-α是被激活的巨噬細胞、小膠質細胞、星型膠質細胞等細胞分泌的一種細胞因子。小膠質細胞是腦內主要的免疫細胞，在腦缺血后幾分鐘激活，激活的小膠質細胞可以產生TNF- α、IL-1等炎癥反應因子。增多的TNF-α、 IL-1可進一步活化小膠質細胞[8]，誘導產生大量炎癥介質，包括轉錄因子核因子NF-κB、TNF、IL 等。TNF-α 與受體 TNFRl (p55)和 TNFR2 (p75)結合后激活蛋白激酶、磷脂酶A2等胞內信使分子，也可活化細胞核內的轉錄因子，促進細胞粘附分子、細胞因子、COX-2及iNOS等的表達。TNF-α不僅能自身激活，而且還能促進其他多種促炎性細胞因子的合成和釋放，并引起細胞因子級聯反應，導致全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征等。

IL-10由Th2細胞、某些Thl細胞、單核-巨噬細胞、B細胞、肥大細胞和角質細胞等產生，是重要的抗炎細胞因子。IL-10作為一種免疫抑制因子，能夠抑制活化單核細胞的促炎因子IL-lα、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和粒細胞、巨噬細胞、集落刺激因子的產生、表達。并可以通過阻斷核轉錄因子NF-κB下調IL-1β、IL-6 等炎癥因子對平滑肌細胞增殖的剌激作用，下調細胞間粘附分子的表達和活性，從而抑制TNF-α和NO，抑制白細胞的聚集，從而起到抗炎作用[9-10]。

本實驗建立了長期大強度運動模型，并觀察大鼠海馬組織中炎性因子NF-κBp65 、TNF-α、IL-10蛋白表達水平的變化，進一步探討運動疲勞的神經生物學機制。結果表明，大強度運動組大鼠NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達水平均較對照組顯著升高，說明長期大強度運動引起的腦缺血缺氧可同時激活促炎反應和抗炎反應。

我國傳統的中醫(yī)藥注重辯證施治，在抗運動疲勞方面具有顯著的優(yōu)勢。長期大強度運動引起的運動疲勞屬于中醫(yī)“勞倦”、“虛勞”的范疇。中醫(yī)理論認為，腎藏精，主骨、生髓，為先天之本，腦為髓海。勞則傷腎，因此長期大強度運動可致腎精不足，髓?？仗?。氣血是人體最基本的生命物質，腦離不開氣血的溫煦、儒養(yǎng)。勞則耗傷氣血等精微物質，腎精不足不能化生氣血，都可導致氣血虧虛，腦失濡養(yǎng)，引起缺血性腦損傷等病理生理過程。由此可見，長期大強度運動后引起的腎精不足，氣血虧虛是運動疲勞的主要病因病機。為此，本研究選用復方中藥益氣養(yǎng)血補腎方進行干預，旨在探討該方對運動疲勞的神經生物學機制，從而為該方藥延緩或消除運動疲勞提供分子水平的理論依據。益氣養(yǎng)血補腎方由八珍湯和肉桂、牛膝、川斷、補骨脂、杜仲、山藥共14味中藥組成，共奏補腎益精、氣血雙補之效。

本研究結果表明，中藥組的NF-κB p65、TNF-α蛋白表達水平較大強度運動組均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10蛋白表達水平較大強度運動組顯著升高(P<0.01)。因此說明，復方中藥益氣養(yǎng)血補腎方可能通過降低NF-κB p65、TNF-α表達水平抑制長期大強度運動引起的炎癥反應，并通過升高IL-10表達水平促進抗炎作用，減輕缺血缺氧性腦損傷，從而發(fā)揮對腦組織及神經功能的保護作用。

綜上所述，長期大強度運動導致的腦缺血缺氧可能引起NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達增加，同時激活促炎反應和抗炎反應。復方中藥益氣養(yǎng)血補腎方可能通過降低NF-κB p65、TNF-α表達水平抑制長期大強度運動引起的炎癥反應，并通過升高IL-10表達水平促進抗炎作用，減輕缺血缺氧性腦損傷，從而發(fā)揮對腦組織及神經功能的保護作用。

參考文獻:

[1]Michael Gleeson. Immune function in sport and exercise [J]. J ApplPhysiol,2007, 103: 693-699.

[2]Neil P.Walsh, Michael Gleeson, Roy J.Shephard, et al. Immune function and exercise [J]. Exerc Immunol Rev，2011，17：6-63.)

[3]田曄，萬琪，王洪典.核因子κB在腦缺血及再灌注損傷炎癥機制中的作用[J].國外醫(yī)學·腦血管疾病分冊，2002，10(2)：143。

[4]吳春燕. 復方中藥對運動疲勞大鼠海馬BDNF及其受體TrkBmRNA和蛋白表達的影響[J]．山東體育科技，2013，35( 5)：70-74.

[5]Bedford T G，Tipton C M，Wilson N C，et al．Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J]．J Appl Physiol，1979，47 ( 6 ) :1278-1283．

[6]Wisloff U，Helgerud J，Kemi O J，et al．Intensity-controlled treadmill running in rats: VO2 max and cardiac hypertrophy[J]．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280:1301-1310．

[7]Podhorska Okolow M，Krajewska B，Carraro U，et al．Apoptosis in mouse skeletal muscles after physical exercise[J]．Folia Histochem Cytobiol，1999，37：127-128.

[8]Kato H, Takahashi A, Itoyama Y. Cell cycle protein expression in proliferating microglia and astrocytes following transient global cerebral ischemia in the rat [J]. Brain Res Bull，2003，60(3): 215-221.

[9]Moore K, Malefyt R, Coffman R, et al. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor [J]. Annu Rev Immunol,2001, 19: 683-765.

[10]Schottelius AJG, Mayo MW, Sartor RB, et al. Interleukin-10 signaling blocks inhibitor of kappa B kinase activity and nuclear factor kappaB DNA binding [J]. J Biol Chem, 1999, 274: 31868-31874.