李 鏘，張 健，王倫興，王召賀，楊再昌，2*

(1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025;2.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

結(jié)核是由結(jié)核桿菌引起的傳染病，全世界范圍內(nèi)每年約有300萬(wàn)人死于結(jié)核。同時(shí)，艾滋病患者免疫功能下降，更易感染結(jié)核桿菌［1-2］。目前，世界上約1/3的人口已感染了結(jié)核桿菌［3-4］，約5千萬(wàn)人感染耐藥結(jié)核桿菌［5-6］。結(jié)核桿菌耐藥后，現(xiàn)有抗結(jié)核藥物很難殺死耐藥菌株。因此，尋找新型抗結(jié)核桿菌活性物質(zhì)具有重大意義。

最早的抗結(jié)核藥物鏈霉素來(lái)自于放線菌，經(jīng)過(guò)幾十年的篩選挖掘，似乎已很難從普通土壤中發(fā)現(xiàn)新的抗菌素生產(chǎn)菌。國(guó)內(nèi)外近年來(lái)在抗結(jié)核藥物研發(fā)方面主要走化學(xué)合成的路子，但是成效并不明顯。

放線菌是一類(lèi)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和多種用途的微生物。目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的8 000多種微生物活性物質(zhì)中，有近70%是放線菌產(chǎn)生的［7］。但是，目前人們分離到的放線菌僅占土壤中所有放線菌的10%左右［8］。自然界豐富的放線菌資源仍具有發(fā)現(xiàn)新型抗結(jié)核藥物的潛力。貴陽(yáng)市花溪區(qū)屬于喀斯特地貌，其淡水資源豐富，從該區(qū)域的淡水底層土壤中分離到24株放線菌，其中的G2株具有抗結(jié)核桿菌活性。筆者報(bào)道了該菌株的分離、鑒定和抗結(jié)核活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。供試G2菌株分離自貴陽(yáng)市花溪區(qū)地表淡水底層土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基。高氏1號(hào)培養(yǎng)基［9］;浙江省結(jié)核病防治所改良羅氏培養(yǎng)基。

1.2 放線菌分離 采用稀釋平板涂抹法［10］分離。將所取土壤樣本用無(wú)菌水稀釋?zhuān)褂眉尤氡椒尤芤?抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng))的高氏一號(hào)培養(yǎng)基(每100 ml高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入2滴濃度10%的苯酚溶液)來(lái)分離樣本中的放線菌。28℃恒溫培養(yǎng)7 d，劃線分離直至純化。

1.3 放線菌鑒定

1.3.1 生理生化特征。參照文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析。將斜面保藏的菌種活化，接種到高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基［12］，接種后放置搖床中培養(yǎng)。搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，28℃恒溫培養(yǎng)7 d。用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。擴(kuò)增采用的引物正向?yàn)?＇-CAGAGTTTGATCCTGGCT＇3＇(7F)，反向?yàn)?5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇(1540R)。PCR 采用 20～50 ng/μl反應(yīng)體系，在94 ℃預(yù)變性4 min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，98℃變性25 s，55℃復(fù)性25 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后在72℃修復(fù)延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收，并且進(jìn)行序列測(cè)定。所測(cè)序列用Blast軟件與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，并且用MEGA6軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，從而確定G2菌株的同源性。

1.4 抗結(jié)核活性測(cè)定

1.4.1 培養(yǎng)基。改良羅氏培養(yǎng)基。

1.4.2 培養(yǎng)液萃取。將高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中放線菌G2培養(yǎng)液過(guò)濾，得到濾液。先用等體積石油醚萃取，回收石油醚得石油醚萃取物;再用等體積乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物;剩余物蒸干。

1.4.3 含藥培養(yǎng)基制備。用二甲基亞砜(DMSO)將上述萃取物和剩余物配成10 mg/ml母液，然后將母液與改良羅氏培養(yǎng)基混合，得到含不同樣本濃度的含藥培養(yǎng)基。每個(gè)樣本平行作3次，以DMSO作溶劑對(duì)照，以異煙肼作陽(yáng)性作藥物對(duì)照。

1.4.4 培養(yǎng)與觀察。將結(jié)核桿菌(H37Rv)懸液(1×107cfu/ml)10 μl接種在斜面含藥培養(yǎng)基表面，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，菌落數(shù)小于5個(gè)的最小濃度定為樣本抑制結(jié)核桿菌的MIC值。

2 結(jié)果與分析

在高氏1號(hào)培養(yǎng)基中，28℃劃線培養(yǎng)7 d后，菌落呈白色，不透明，最初表面相當(dāng)光滑，然后發(fā)育一層短菌絲體，可能呈顆粒狀、絨狀或毛狀，干燥，不易挑起(圖1A)。革蘭氏染色呈紫色(圖1B)，為革蘭氏陽(yáng)性菌。菌株G2的主要生理生化特征與白淺灰鏈霉菌基本保持一致。

凝膠電泳分析結(jié)果(圖2)顯示，擴(kuò)增的DNA片段S1911在約1 500 bp(base pair)處有一條明亮的PCR特征性條帶，用Applied Biosystems 3730XL測(cè)序軟件得出該菌株的DNA序列為CTGGCTCAGG-GGACGAAGTC，長(zhǎng)度為1 461 bp。

將所測(cè)序列與NCBI上已登錄的同屬16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)。由圖3可知，G2菌株與登錄號(hào)為DQ491194的菌株Streptomyces albogriseolus;B191(白淺灰鏈霉菌)的同源性最高，達(dá)到97%。

根據(jù)G2菌株的菌落、細(xì)菌形態(tài)和生理生化特性，結(jié)合16s rRNA進(jìn)行序列比對(duì)結(jié)果，將G2菌株鑒定為白淺灰鏈霉菌。

G2菌株培養(yǎng)液經(jīng)分段萃取后，得到石油醚、乙酸乙酯萃取物和萃取后的剩余物。從表1可以看出，G2菌株培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取物和萃取后剩余物具有抗結(jié)核桿菌的活性，乙酸乙酯萃取物和剩余物的MIC值分別為為400和800 μg/ml，石油醚萃取物無(wú)活性，可見(jiàn)其活性成分應(yīng)為具有一定極性的小分子化合物。

表1 G2菌株培養(yǎng)液抗結(jié)核桿菌活性

3 討論

全世界每年約有140萬(wàn)人死于結(jié)核病，尤其是耐藥結(jié)核桿菌感染，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成重大威脅。因此，研發(fā)新的抗結(jié)核藥物任務(wù)艱巨。G2菌株屬白淺灰鏈霉菌。許多白淺灰鏈霉菌能產(chǎn)生一種或多種抗細(xì)菌、抗真菌、抗藻類(lèi)、抗病毒、抗原生動(dòng)物或抗腫瘤的抗菌素。有報(bào)道指出，白淺灰鏈霉菌發(fā)酵物乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性［13］。李曉玲［14］研究表明，紅樹(shù)植物來(lái)源的白淺灰鏈霉菌MGR072蘊(yùn)藏著豐富的生物堿類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，是尋找藥物先導(dǎo)化合物的重要資源。但迄今為止，有關(guān)淺灰白鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物抗結(jié)核桿菌方面的研究不多。結(jié)果表明，G2培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取物具有抗結(jié)核桿菌活性，G2菌株分離自淡水底層土壤。這一發(fā)現(xiàn)提示具特殊地貌的土壤放線菌具有進(jìn)一步挖掘新型抗結(jié)核藥物的潛力。G2菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物成分極其復(fù)雜，其抗結(jié)核桿菌的活性弱可能與有效成分含量不高有關(guān)。雖然萃取后剩余物也顯示出抗結(jié)核桿菌活性，很有可能是萃取不徹底造成的，當(dāng)然并不排除剩余物存在不同于乙酸乙酯萃取物的活性成分。筆者擬對(duì)G2菌株的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行活性跟蹤分離，得到活性單體，并且進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和作用機(jī)制探討，相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

［1］MARíA DEL RAYO CAMACHO-CORONA，MóNICA A.RAMíREZ-CABRERA，OMAR GONZáLEZ-SANTIAGO，et al.Activity against drug resistant-tuberculosis strains of plants used in mexican traditional medicine to treat tuberculosis and other respiratory diseases［J］.Phyother Res，2008，22:82-85.

［2］ELOUARTI A，HAOUAT A C，SQALLI H，et al.Extra-and intracellular antimycobacterial activity of Arbutus unedo L［J］.Afr J Microbiol Res，2012，6:1283-1290.

［3］DYE C.Global epidemiology of tuberculosis［J］.Lancet，2006，367:938-940.

［4］WHO:Global Tuberculosis Control:Epidemiology，Strategy and Financing.Geneva，Switzerland:WHO/HTM/TB/2009.411［R］.2009.

［5］WHO:Global Tuberculosis Control-Surveillance，Planning and Financing.Geneva，Switzerland:WHO/HTM/TB/2007.376［R］.2007.

［6］WHO.耐藥結(jié)核病臨床醫(yī)生使用指南［S］.2版.北京:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治中心，2010.

［7］姜成林，徐麗華.放線菌資源的開(kāi)發(fā)利用［J］.工業(yè)微生物，1989，19(6):31-35.

［8］張紀(jì)忠，黃靜娟，盛宗斗，等.微生物分類(lèi)學(xué)［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，1985:214-218.

［9］程麗娟，薛泉宏，來(lái)航線，等.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.西安:世界圖書(shū)出版公司，1988.

［10］楊宇容，徐麗華，李啟任，等.低溫環(huán)境中放線菌的研究［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1997(4):397-402.

［11］阮繼生，黃英.放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類(lèi)［M］.北京:科學(xué)出版社，2011:116-152

［12］ZUO Y X，LI L，ZHANG T，et al.Contribution of Streptomyces in sediment to earthy odor in the overlying water in Xionghe reservoir，China［J］.Water Research，2010，44(20):6085-6094.

［13］古靜燕.海洋白淺灰鏈霉菌Streptomyces Albogriseolus A2002抗腫瘤活性成分的研究［D］.青島:中國(guó)海洋大學(xué)，2004.

［14］李曉玲.紅樹(shù)林來(lái)源白淺灰鏈霉菌MGR072次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究和核糖體工程優(yōu)化［D］.北京:國(guó)家海洋局第三海洋研究所，2011.