芪衛(wèi)顆粒對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞nephrin表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

·論著·

作者單位：100069北京,首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[王馨瑤(碩士研究生)、耿建國、高彥彬、李嬌陽(碩士研究生)、周盛楠(碩士研究生)、鄒大威、劉迎新(碩士研究生)];中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[王馨瑤(碩士研究生)、耿建國、高彥彬]

芪衛(wèi)顆粒對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞nephrin表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

王馨瑤耿建國高彥彬李嬌陽周盛楠鄒大威劉迎新

【摘要】目的探討芪衛(wèi)顆粒對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin表達(dá)的影響。方法隨機(jī)選取10只健康雄性SD大鼠為正常組，其余30只采用腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素(60 mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組以及芪衛(wèi)顆粒組，將西藥組按纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃、芪衛(wèi)顆粒組按生藥10 g/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥。于給藥第24周檢測大鼠血肌酐、血尿素氮及內(nèi)生肌酐清除率；24周后將大鼠處死，采用PAS染色法將腎組織染色，在光鏡下觀察大鼠腎組織病理改變；采用western blot法檢測腎組織足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin表達(dá)情況。結(jié)果與正常組相比，模型組大鼠血肌酐、血尿素氮水平顯著升高，內(nèi)生肌酐清除率及足細(xì)胞nephrin表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組大鼠血肌酐、血尿素氮水平明顯下降，內(nèi)生肌酐清除率及nephrin表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論芪衛(wèi)顆粒能夠上調(diào)糖尿病腎病大鼠腎組織足細(xì)胞nephrin的表達(dá)，減輕足細(xì)胞損傷，保護(hù)腎功能，延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】芪衛(wèi)顆粒；糖尿病腎?。蛔慵?xì)胞；nephrin

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB518602);國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81173238)

作者簡介:王馨瑤(1989- )，女，2012級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥。E-mail：wangxinyao0421@aliyun.com

通訊作者：耿建國(1956- )，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥。E-mail：gengdoctor@sina.com.cn

【中圖分類號(hào)】R285.5

收稿日期：(2014-10-20)

Influence ofQiweiGranules on the expression of nephrin in podocyte of rats with diabetic nephropathyWANGXin-yao，GENGJian-guo，GAOYan-bin，etal.CapitalMedicalUniversitySchooloftraditionalChineseMedicine,Beijing100069,China

Correspondingauthor:GENGJian-guo，E-mail:gengdoctor@sina.com.cn

Abstract【】ObjectiveThe study aims to investigate the effects of Qiwei Granules on the expression of nephrin in podocytes of rats with diabetic nephropathy (DN). Methods10 normal male SD rats were chosen randomlyas the normal group, and the other 30 rats were abdominally administered with a single injection of streptozotocin (60mg/kg) to induce DN rat models. The model rats were divided into 3 groups randomly: the model group, the western medicine group and Qiwei Granules group, Qiwei Granules group was given the prescription of Qiwei of 10 g /( kg·d), Western medicine group was given valsartan of 10 mg/( kg·d) for 24 weeks．The changes in blood urea nitrogen, serum creatinine and urinary were observed in the 24th week. After 24 weeks, all the rats were sacrificed. The pathological change of renal tissue was detected by PAS. And the expression of nephrin in podocyte was observed by western blot. ResultsCompared with normal control group, the renal function and the expression of nephrin in model groupwere significantly decreased (P<0.05). Compared with model group, the renal function and the expression of nephrin in other groups were significantly increased (P<0.05). ConclusionThe taking of Qiwei Granules could up-regulate the expression of nephrin in podocyte, decrease the damage of podocyte, and improve the renal function, which may slow the progression of DN.

【Key words】QiweiGranules;Diabetic nephropathy;Podocyte;Nephrin

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)多在糖尿病發(fā)病后5～10年發(fā)生，是導(dǎo)致終末期腎病發(fā)生的最主要病因。既往對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)的堆積、腎小球基底膜的增厚、腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化等[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷是本病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[2-3]，尤以足細(xì)胞中裂孔隔膜蛋白損傷最為重要。nephrin是現(xiàn)今公認(rèn)最重要的裂孔隔膜蛋白，當(dāng)其表達(dá)異常時(shí)，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能則發(fā)生異常改變，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能減退，腎功能下降，促進(jìn)DN的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。因此，調(diào)節(jié)裂孔隔膜蛋白nephrin表達(dá)，保護(hù)足細(xì)胞，是延緩本病發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察芪衛(wèi)顆粒對(duì)DN大鼠腎組織足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響，探討其對(duì)DN大鼠腎組織足細(xì)胞的保護(hù)作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2試劑及藥物

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma，批號(hào)：S1030)檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，0.1M，pH:4.4，批號(hào)：32J00101)。芪衛(wèi)顆粒(主要成分：黃芪12 g、生地10 g、衛(wèi)矛10 g、大黃6 g，由首都醫(yī)科大學(xué)中藥制劑室制備)。纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X1440)。Rat nephrin(Sigma,PRS2265-100UG)。

1.3主要儀器

酶標(biāo)儀(北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司，ZS-3)；離心機(jī)(Sigma，3K18)；電泳儀(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，DG-300C)；迷你雙垂直電泳槽(北京市六一儀器廠，DYCZ-24DN)；迷你轉(zhuǎn)印電泳槽(北京市六一儀器廠，DYCZ-40D)；水平搖床(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，TDK-2)；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所，JY92-II)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，TGL-20M)。

1.4模型建立和分組給藥

將40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：一組10只為正常組；另一組30只為造模組。造模組采用腹腔注射大劑量STZ(60 mg/kg)方法造模，三天后檢測空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功。造模成功后，隨機(jī)分為三組，將西藥組按纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃、芪衛(wèi)顆粒組按生藥10 g/(kg·d)灌胃；正常組及模型組予等量蒸餾水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間自由飲食，連續(xù)給藥24周。

1.5標(biāo)本采集和檢測方法

于實(shí)驗(yàn)第24周將大鼠斷尾取血2 mL，靜置20分鐘左右，離心2000～3000 r/min，20分鐘，分離血清進(jìn)行血尿素氮、血肌酐的檢測，并按照公式計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率，即內(nèi)生肌酐清除率=尿肌酐×總尿量(mL/24h)/血肌酐/1440(min)/BW(g)×100，單位為mL/(min·BW/100)。于實(shí)驗(yàn)第24周末取材，取出腎臟去除包膜及周圍結(jié)締組織，常規(guī)制片，PAS染色法染色。用western blot檢測nephrin表達(dá)情況，檢測結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參，使用Quantity One軟件分析；PAS染色結(jié)果在400倍鏡下進(jìn)行觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1各組大鼠血肌酐、血尿素氮及內(nèi)生肌酐清除率的比較

于給藥第24周測定大鼠血肌酐、血尿素氮及內(nèi)生肌酐清除率。與正常組相比，模型組及各給藥組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯上升，內(nèi)生肌酐清除率顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯下降，內(nèi)生肌酐清除率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各給藥組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，詳見表1。提示芪衛(wèi)顆粒能夠顯著改善DN大鼠腎功能。

2.2各組大鼠腎組織足細(xì)胞nephrin表達(dá)比較

于實(shí)驗(yàn)第24周使用western blot檢測結(jié)果如下，與正常組相比，模型組大鼠足細(xì)胞nephrin表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組大鼠足細(xì)胞nephrin表達(dá)顯著升高(P<0.05)，各給藥組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，詳見圖1。提示芪衛(wèi)顆粒可上調(diào)腎組織足細(xì)胞nephrin表達(dá)。

表1　給藥24周后各組大鼠血肌酐、血尿素氮及

注：與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,aP<0.05；與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,bP<0.05

圖1　給藥24周各組大鼠足細(xì)胞nephrin蛋白表達(dá) (western blot)

2.3腎組織PAS染色

光鏡下可見，正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無明顯異常，腎小球基底膜無異常增厚；模型組大鼠腎組織系膜增生明顯，細(xì)胞外基質(zhì)顯著增多，部分腎小球出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣硬化，PAS染色面積較兩給藥組增加；兩給藥組PAS染色面積較模型組明顯減少，病變較模型組減輕。詳見圖2。

A正常組　B模型組　C西藥組　D芪衛(wèi)顆粒組

3討論

近年對(duì)于DN發(fā)病機(jī)制的研究表明[6-7]：足細(xì)胞的裂孔隔膜是腎小球?yàn)V過屏障的最后一道防線，而高糖狀態(tài)可直接導(dǎo)致足細(xì)胞損傷；當(dāng)足細(xì)胞及其裂孔隔膜蛋白受到損傷時(shí)則導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)，最終導(dǎo)致腎小球硬化癥。nephrin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白，也是最重要的裂孔隔膜蛋白，具有維持腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)及功能完整性的作用[8-9]。有研究表明[10-11]：nephrin是腎小球損傷的早期指標(biāo)，其表達(dá)減少直接導(dǎo)致了腎小球?yàn)V過功能喪失及腎功能異常。近年來國內(nèi)外相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)[12-13]：nephrin蛋白異常表達(dá)不僅與先天性腎病有關(guān)，還與多種繼發(fā)性腎病相關(guān)，當(dāng)nephrin表達(dá)異常時(shí)，可引起腎功能異常及大量蛋白尿的發(fā)生。因此，調(diào)節(jié)nephrin表達(dá)，減輕足細(xì)胞損傷，就成為防治DN的重要環(huán)節(jié)。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎病主要病機(jī)為氣陰兩虛，腎絡(luò)瘀阻[14-15]；治療則采用益氣養(yǎng)陰，活血祛瘀通絡(luò)之法。芪衛(wèi)顆粒是高彥彬教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬定的方劑，方中黃芪、生地益氣養(yǎng)陰，扶助正氣；衛(wèi)矛、大黃活血通絡(luò)，蠲除邪氣，上藥共奏益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀通絡(luò)之效。前期實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究證實(shí)：本方具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β/Smads信號(hào)通路、降低尿蛋白，顯著改善患者腎功能的作用[16-19]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明：芪衛(wèi)顆粒能夠降低大鼠血肌酐、血尿素氮，升高內(nèi)生肌酐清除率，上調(diào)nephrin表達(dá)，減輕足細(xì)胞損傷，改善腎臟功能。其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin的表達(dá)，減輕DN大鼠足細(xì)胞損傷，保護(hù)腎組織，從而延緩DN的發(fā)生、發(fā)展。其詳細(xì)的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：蒲曉田)