電子煙煙氣捕集液對CHO細(xì)胞相對增殖率的影響

（云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南昆明650024）

電子煙煙氣是通過電子煙霧化器加熱電子煙煙油產(chǎn)生的如香煙一樣的煙氣。該煙氣產(chǎn)生的原理和成分都與卷煙有著很大差別，因此對電子煙煙氣的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行評價十分必要。研究表明，電子煙煙氣的主要成分有丙二醇、甘油、尼古丁、乙醛等一些易溶于水的化合物［1－2］，而目前關(guān)于電子煙煙氣引起的生物學(xué)效應(yīng)的報道比較少。鑒于此，作者采用細(xì)胞培養(yǎng)基對電子煙煙氣的水溶性成分進(jìn)行捕集，通過MTT 法研究電子煙煙氣捕集液對體外培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞的相對增殖率的影響，以期為電子煙研發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

電子煙樣品，自制。1?！?＃電子煙樣品的煙堿含量（mg·mL－1）分別為18、12、8；陰性對照為以滅菌蒸餾水為煙油的電子煙；陽性對照為肯塔基大學(xué)參比卷煙3R4F。

CHO 細(xì)胞，ATCC；DMEM／F12 培養(yǎng)基、胎牛血清，Gibco；MTT，Sigma。

SM450型20 孔道直線式吸煙機(jī)，CERULEAN；HFsafe－1500型二級生物安全柜；3111 型CO2培養(yǎng)箱，Thermo Forma；680型酶標(biāo)儀，Bio－Rad。

1.2 方法

1.2.1 電子煙與3R4F的煙氣捕集

將4.5 mL 不加血清的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM／F12加入已滅菌的“一種用于電子煙煙氣生物學(xué)效應(yīng)評價的煙氣捕集裝置”的煙氣捕集瓶中，將直線式吸煙機(jī)煙氣來路膠管緊密連接于捕集裝置的煙氣進(jìn)氣口上；將捕集瓶的煙氣出口與吸煙機(jī)回路緊密連接；按照加拿大Labstat電子煙抽吸模式（抽吸容量55 mL，間隔30s，頻率4s）設(shè)定自動吸煙程序［3］；每支電子煙抽吸100口，陰性對照抽吸100口，陽性對照3R4F 抽吸一支（電子煙是經(jīng)霧化器對電子煙煙油進(jìn)行霧化，不需要點(diǎn)燃，3R4F需要點(diǎn)燃）。

1.2.2 煙氣濃度的設(shè)定

將收集到的電子煙煙氣捕集液4.5mL 轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入0.5mL 胎牛血清，設(shè)定其為100%煙氣濃度（原液）；用含有10%胎牛血清的DMEM／F12細(xì)胞培養(yǎng)基將原液分別稀釋至50%煙氣濃度、25%煙氣濃度、12.5%煙氣濃度、6.25%煙氣濃度。

將收集到的3R4F煙氣捕集液按相同方法設(shè)定濃度［4］。

1.2.3 MTT 實(shí)驗(yàn)

將CHO 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞生長達(dá)到近匯合，且細(xì)胞處于指數(shù)分裂期。移除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入適量胰蛋白酶溶液孵育約1 min，用細(xì)胞生長培養(yǎng)基懸起，形成單細(xì)胞懸浮液。用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計算每毫升細(xì)胞懸浮液中的活細(xì)胞數(shù)，用細(xì)胞生長培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸浮液，使CHO 細(xì)胞濃度達(dá)到0.8×105～1.2×105個·mL－1。將細(xì)胞懸浮液接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種量為100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

移除96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，將200μL 煙氣濃度分別為100%、50%、25%、12.5%和6.25%的煙氣捕集液加入96孔板中，每個濃度設(shè)8個平行；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。按常規(guī)方法進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)［5］，按下式計算細(xì)胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）：

式中：ODn為樣品組的多孔平均吸收值；OD0為空白對照組的多孔平均吸收值；ODc為陰性對照組的多孔平均吸收值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（珚x±s）表示，結(jié)果采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，同一樣品不同濃度之間差異比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA）［6］，不同樣品不同濃度之間差異采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 電子煙和3R4F煙氣捕集液濃度對CHO 細(xì)胞相對增殖率的影響（圖1）

圖1 煙氣捕集液對CHO 細(xì)胞相對增殖率的影響Fig.1 Effect of cigratte smoke in cell culture medium on RGR of cell CHO

由圖1可看出：1＃電子煙煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細(xì)胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的1.42倍（圖1a）；2＃電子煙煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細(xì)胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的1.32倍（圖1b）；3＃電子煙煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細(xì)胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的1.27 倍（圖1c）?？梢姡S著3種電子煙煙氣稀釋倍數(shù)的增大，CHO 細(xì)胞的相對增殖率均相應(yīng)升高。

采用SPSS13.0軟件對1＃、2＃、3＃電子煙煙氣捕集液對CHO 細(xì)胞相對增殖率的影響進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一樣品不同濃度之間存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖1d可看出：隨著3R4F 煙氣稀釋倍數(shù)的增大，CHO 細(xì)胞的相對增殖率相應(yīng)升高；3R4F 煙氣捕集液6.25%煙氣濃度時的細(xì)胞相對增殖率是100%煙氣濃度時的16.67倍。

采用SPSS13.0軟件對3R4F煙氣捕集液對CHO細(xì)胞相對增殖率的影響進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一樣品不同濃度之間存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 電子煙和3R4F煙氣捕集液的CHO 細(xì)胞相對增殖率的比較（表1）

表1 電子煙和3R4F煙氣捕集液的CHO 細(xì)胞相對增殖率的比較（珔x±s，n＝3）Tab.1 Comparison of RGR of cell CHO for electronic cigratte smoke and 3R4Fsmoke in cell culture medium（珔x±s，n＝3）

由表1 可知：3 種電子煙和3R4F 煙氣捕集液對CHO 細(xì)胞相對增殖率的影響有顯著差異（P＜0.05）；3種電子煙之間沒有顯著差異（P＞0.05）；在100%煙氣濃度下，電子煙煙氣捕集液的CHO 細(xì)胞相對增殖率是3R4F 的10 倍以上，其中，1＃為13.7 倍，2＃為14.6倍，3＃為15.2倍。

3 結(jié)論

在加拿大Labstat電子煙抽吸模式下，分別抽吸100口電子煙和一支3R4F，用4.5mL 的細(xì)胞培養(yǎng)基捕集煙氣后染毒CHO 細(xì)胞進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：抽吸一支3R4F的煙氣捕集液對CHO 細(xì)胞相對增殖率的影響明顯大于抽吸100口電子煙煙氣捕集液產(chǎn)生的影響；在100%煙氣濃度下，電子煙煙氣捕集液的CHO 細(xì)胞相對增殖率是3R4F 的10倍以上。表明，該方法用于檢測電子煙煙氣捕集液對細(xì)胞相對增殖率的影響是可行的，可為電子煙研發(fā)提供參考。

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［6］王立芹，楊俊英，唐龍妹，等.單因素重復(fù)測量設(shè)計的方差分析及SAS與SPSS的實(shí)現(xiàn)［J］.華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，7（1）：17－19.