楊 雙，張長波，王景安，劉仲齊

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津300191）

鎘（Cd）是生物毒性很強的重金屬元素［1］，是植物生長和發(fā)育的非必需元素，過量會抑制植物的生長［2］。由于含鎘工業(yè)污水的排放和含鎘化肥、農藥的長期使用，大量的鎘進入農田生態(tài)系統(tǒng)，造成農田土壤鎘含量嚴重超標。水稻是我國的主要農作物，全國約有60%的人口以大米為主食。與其它重金屬元素相比，鎘的活性較強，容易被水稻吸收和富集，可以在不影響水稻正常生長的情況下積累較高含量的鎘，因此水稻鎘污染具有很強的隱蔽性和危險性［3］。據不完全統(tǒng)計，我國受鎘污染的農田面積已超過20萬hm2，每年生產鎘含量超標的農產品達14.6億kg［4］，嚴重危害了廣大人民群眾的身體健康。

木質纖維素是可再生且來源廣泛的可利用資源。但是木質纖維素中的纖維素不僅由木質素和半纖維素包裹著，而且纖維素分子中存在大量的氫鍵及結晶區(qū)、非結晶區(qū)共存的復雜形態(tài)結構，具有不熔化和在大多數溶劑中不溶解的特點［5］。木質纖維素經預處理后能打破由木質素和半纖維素構成的網狀包埋結構，使纖維素與木質素、半纖維素等分離，同時纖維素內部氫鍵打開，成為無定形的纖維素，降低纖維素的結晶度，提高基質的孔隙度，最終提高纖維素的酶解效率、原料利用率和總得糖率［6－8］。

作者在此以不同鎘含量的T 優(yōu)705水稻秸稈（以下簡稱稻稈）為原料，采用10%NaOH 和過氧乙酸（PAA）預處理稻稈，比較不同預處理前后稻稈中鎘含量的變化及其對纖維素酶解效率的影響，利用其中重金屬的有意作用，合理地、最大限度地利用這些資源，為富鎘稻稈的綜合利用提供參考。

1 實驗

1.1 稻稈的預處理

在鎘污染程度不同的盆栽試驗中，收集秈稻品種T 優(yōu)705的秸稈，自然風干后用萬能粉碎機粉碎，過60目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻［9－11］，分別采用10%NaOH 和PAA 對木質纖維素進行化學預處理。

1）10%NaOH 預處理：稱取粉碎稻稈10g，按料液比1∶3（g∶mL，下同）加入到10%NaOH 溶液中，在90 ℃水浴鍋中保溫1.5h，用水沖洗預處理后的稻稈，直至pH 值為中性，去除多余水分，重復3次，將所得稻稈殘渣烘干、稱量后，保存?zhèn)溆谩?/p>

2）PAA 預處理：取稻稈，按料液比1∶1 加入15%PAA，在75 ℃水浴鍋中保溫3h，用水沖洗至pH值為中性，去除多余水分，重復3次，將所得稻稈殘渣烘干、稱量后，保存?zhèn)溆谩?/p>

3）10%NaOH ＋PAA 復合預處理：取經10%NaOH 預處理后的稻稈殘渣按上述方法進行PAA 預處理，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鎘含量的測定

參照文獻［12］，分別稱取稻稈和稻稈殘渣0.25g于聚四氟乙烯消煮管中，加入7mL 70%硝酸泡6h后，在ED54型長管消解儀中110 ℃消煮2.5h，每隔30 min振蕩一次，然后加入1mL 30%過氧化氫，繼續(xù)保持110 ℃消煮1.5h，最后在180 ℃的條件下趕酸，直至所剩液體為0.5 mL 左右，定容至25 mL，過濾，用AAS ZEEnit 700型原子吸收光譜儀測定鎘含量，重復3次。

1.3 酶解

在300mL錐形瓶中加入0.5g預處理前后的不同鎘含量稻稈，按料液比1∶100加入pH 值為4.8的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液作為酶解體系，加入酶濃度為350U 的纖維素酶（北京鼎國公司，酶活為10 000U·g－1）1mL，在150r·min－1、50℃的條件下進行酶解。前12h每隔2h取樣測定葡萄糖濃度，12h后每隔12h取樣測定葡萄糖濃度，重復3 次，以無鎘稻稈作為對照。

1.4 酶解產物的衍生化和GC－MS測定

纖維素酶解產生的葡萄糖沒有足夠的揮發(fā)性，需將其轉化為揮發(fā)性衍生物才能進行GC－MS測定。本實驗采用常用的硅烷化作為衍生化手段［13］，參照文獻［14－15］對酶解產物進行衍生化，利用衍生化試劑N，O－雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）與經10%NaOH＋PAA 復合預處理后的稻稈酶解產物葡萄糖發(fā)生三甲基硅烷化衍生反應，獲得具有良好揮發(fā)性和穩(wěn)定性的衍生產物硅醚或硅酯，并用N，N－二甲基甲酰胺（DMF）作為溶劑，實現反應后衍生產物與樣品殘余物的兩相分離，最后進行GC－MS測定。

具體過程：取50μL酶解液于衍生化試管中，真空干燥揮干溶劑后加入衍生化試劑BSTFA 和DMF 各50μL，在75 ℃的條件下進行衍生化反應，30min后，加入900μL 丙酮，并在旋渦振蕩器上充分混勻，過0.22μm 的有機相濾膜后用氣質聯用儀（美國Agilent公司）進行GC－MS測定。

1.5 葡萄糖產量的測定

用氣質聯用儀進行分析測定。通過MSD 化學工作站數據處理系統(tǒng)，檢索NIST08譜圖庫，將測得的譜圖與標準譜圖和標準樣品譜圖進行對照、復合，再結合有關文獻進行人工譜圖解析。按下式計算葡萄糖產量：

式中：GY為葡萄糖產量，g·kg－1；GC為1kg底物酶解得到的葡萄糖濃度，g·L－1；V為反應體系總體積，L；M為稻稈總質量，kg；0.9為葡萄糖的水化因子［16］。

2 結果與討論

2.1 預處理方法對稻稈纖維素中鎘含量的影響（表1）

表 1 預處理方法對稻稈纖維素中鎘含量的影響／（mg·kg－1）Tab.1 Influence of pretreatment methods on cadmium content of rice straw cellulose／（mg·kg－1）

由表1 可知：（1）2 種不同鎘含量的稻稈經10%NaOH 預處理后，鎘含量沒有明顯變化，說明堿對鎘的去除沒有影響；（2）PAA 預處理后，2種稻稈的鎘含量均降低了80%以上，說明PAA 可以去除稻稈中的鎘；（3）單位質量的稻稈經過PAA 預處理后鎘的流失率高達88%，經過10%NaOH＋PAA 復合預處理后鎘的流失率高達99%，說明半纖維素和木質素中的鎘含量至少為11%。這是因為，NaOH 有較強的脫木質素和降低結晶度的作用［6］，它和PAA 復合預處理稻稈后，稻稈中的半纖維素和木質素被全部去除［17］，同時部分纖維素也隨之流失。

2.2 復合預處理對稻稈纖維素酶解效率的影響

2.2.1 復合預處理后的稻稈酶解產物衍生化后的GC－MS分析（圖1）

單糖經三甲基硅烷化試劑衍生化后，產物葡萄糖分子每個羥基上的氫原子均被一個三甲基硅烷基團取代，使葡萄糖分子的極性降低［18］。由圖1 可以看到，每個化合物的離子中，都含有m／z73 這個碎片離子，即三甲基硅烷正離子碎片，豐度較大，說明該化合物是三甲基硅烷化衍生產物，符合測定的結果［19］。在質譜圖中產生的主要離子碎片還有：m／z204、m／z191、m／z147，其中m／z204為基峰?；宓漠a生是由于葡萄糖衍生化產物的分子結構不穩(wěn)定，其C1－C2鍵、C5－C6鍵斷裂后，生成m／z408的離子碎片，剩余的中間四碳不穩(wěn)定導致C3－C4鍵繼續(xù)斷裂，生成了穩(wěn)定的m／z204離子碎片［18］，表明測得的物質即為目標產物。

由于葡萄糖分子存在α和β2 種不同構型，所以其三甲基硅烷衍生物在色譜圖中同時出現2個峰［15］。在色譜條件下，目標產物在8.411 min的出峰面積很穩(wěn)定（圖2），與標準樣品中的葡萄糖濃度呈極顯著線性相關。根據未知樣品的讀數值和標準曲線進行比較，就能準確測定未知樣品中的葡萄糖濃度。

圖1 酶解產物衍生化后的GC－MS圖譜Fig.1 GC－MS Spectrum of enzymatic hydrolysis sample after derivatization

圖2 酶解產物衍生化后的總離子流圖譜Fig.2 Total ion current chromatogram of enzymatic hydrolysis sample after derivatization

2.2.2 復合預處理對不同鎘含量稻稈酶解效率的影響（圖3）

由圖3可看出：（1）未處理稻稈的酶解效率均很低，其中無鎘稻稈隨酶解時間的延長，葡萄糖濃度略有升高，從3.4g·L－1升高到3.8g·L－1；含鎘稻稈的葡萄糖濃度均比無鎘稻稈的葡萄糖濃度低，且隨著酶解時間的延長沒有明顯的變化，鎘含量為2mg·kg－1的稻稈葡萄糖濃度保持在3.34g·L－1，鎘含量為8 mg·kg－1的稻稈葡萄糖濃度保持在3.32g·L－1。（2）不同鎘含量稻稈經過10%NaOH＋PAA 復合預處理后，葡萄糖濃度均呈指數顯著升高，24h后，葡萄糖濃度升幅趨緩，說明酸堿復合預處理破壞了稻稈木質纖維素的結構，堿可以潤脹纖維素，酸可以溶解半纖維素、氧化木質素，都不同程度地使木質素氧化，減弱了它們之間結合的作用力，增大了纖維素酶和纖維素的作用面積［7］。（3）不同鎘含量稻稈經復合預處理后酶解所得葡萄糖濃度差異顯著，鎘含量越高酶解效率越高，酶解72h后，無鎘稻稈的葡萄糖濃度為8.28g·L－1，富鎘稻稈的葡萄糖濃度為10.55g·L－1，較無鎘稻稈的葡萄糖濃度高出27.4%。

圖3 復合預處理對不同鎘含量稻稈酶解效率的影響Fig.3 Influence of compound pretreatment on enzymatic hydrolysis efficiency of rice straw with different contents of cadmium

上述結果表明，復合預處理后，鎘的存在提高了稻稈中纖維素的酶解效率，且在一定范圍內，鎘含量越高，纖維素的酶解效率越高。這是因為，植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質素和果膠質組成［20］，細胞壁含有豐富的親鎘物質，還含有與鎘關聯的陽離子交換位點［21］，所以細胞壁中含有大量的鎘。細胞初生細胞壁中纖維素等形成的網架結構存在許多大小不一的網孔，在較小的網孔處，帶正電的鎘離子被帶負電的親鎘物質所吸附［22］。鎘離子被纖維素的網狀結構所吸收、固定。當對稻稈進行預處理后，纖維素成分中的鎘連同部分親鎘物質一起被洗掉，但是原來的空隙仍然保留，結果使纖維素的比表面積增大，從而增大了纖維素與酶的接觸面積，最終提高了纖維素的酶解效率。

2.3 復合預處理對稻稈葡萄糖產量的影響（圖4）

由圖4可看出：（1）稻稈直接酶解時，含鎘稻稈的葡萄糖產量顯著低于無鎘稻稈；但富鎘和低鎘稻稈的葡萄糖產量無顯著差異，無鎘稻稈的葡萄糖產量為351.82g·kg－1，鎘含量為2mg·kg－1的稻稈葡萄糖產量比無鎘稻稈低12.3%，鎘含量為8 mg·kg－1的稻稈葡萄糖產量比無鎘稻稈低14.2%。（2）不同鎘含量稻稈經復合預處理后再酶解時，殘渣的葡萄糖產量與鎘含量成正比，鎘含量越高，葡萄糖產量越高，無鎘稻稈葡萄糖產量為760.23g·kg－1，低鎘稻稈葡萄糖產量比無鎘稻稈高17.4%，富鎘稻稈葡萄糖產量比無鎘稻稈高27.4%。

圖4 復合預處理對稻稈葡萄糖產量的影響Fig.4 Influence of compound pretreatment on yield of glucose

2.4 復合預處理前后稻稈的掃描電鏡照片分析（圖5）

圖5 復合預處理前（a）后（b）稻稈的掃描電鏡照片Fig.5 SEM Images of rice straw before（a）and after（b）compound pretreatment

由圖5可看出：未經預處理的稻稈的木質纖維素結構緊密有序，表面粗糙呈塊狀（圖5a）；經復合預處理的稻稈的晶狀結構遭到破壞，表面呈條狀，變得松散、光滑、柔軟（圖5b），稻稈的比表面積增大、孔隙度增加，易于酶解［23］。這也是預處理后水稻樣品具有高葡萄糖產量的主要原因。

3 結論

采用不同的預處理方法分別對不同鎘含量的稻稈進行預處理。結果表明：（1）酸可以去除稻稈中大量的鎘，而堿對稻稈殘渣中鎘含量沒有顯著影響。（2）稻稈中的鎘含量對稻稈纖維素的酶解效率有顯著影響。鎘含量越高，預處理后的酶解效率越高。未經預處理的富鎘稻稈，其纖維素酶解效率低于無鎘稻稈。（3）10%NaOH＋PAA 復合預處理使稻稈纖維的表面結構變得疏松，極大地提高了稻稈纖維素的酶解效率，復合預處理可使稻稈纖維素的葡萄糖產量提高1～3倍。

［1］陳京都，劉萌，顧海燕，等.不同土壤質地條件下麥秸、鉛對鎘在水稻－土壤系統(tǒng)中遷移的影響［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2011，30（7）：1295－1299.

［2］陳京都，戴其根，許學宏，等.江蘇省典型區(qū)農田土壤及小麥中重金屬含量與評價［J］.生態(tài)學報，2012，32（11）：3487－3496.

［3］陳京都.水稻鎘脅迫響應差異機理和調控效應的研究［D］.揚州：揚州大學，2013.

［4］王琴兒，曾英，李麗美.鎘毒害對水稻生理生態(tài)效應的研究進展［J］.北方水稻，2007，（4）：12－16.

［5］邢麗欣.離子液體溶解和降解稻稈纖維素制備還原糖的研究［D］.哈爾濱：哈爾濱理工大學，2011.

［6］趙志剛，程可可，張建安，等.木質纖維素可再生生物質資源預處理技術的研究進展［J］.現代化工，2006，26（2）：36－42.

［7］尉慰奇.桉木原料的預處理及其酶解糖化的研究［D］.廣州：華南理工大學，2012.

［8］計紅果，龐浩，張容麗，等.木質纖維素的預處理及其酶解［J］.化學通報，2008，71（5）：329－335.

［9］ZHAO X B，WU R C，LIU D H.Production of pulp，ethanol and lignin from sugarcane bagasse by alkali－peracetic acid delignification［J］.Biomass and Bioenergy，2011，35（7）：2874－2882.

［10］DUAN X J，ZHANG C B，JU X H，et al.Effect of lignocellulosic composition and structure on the bioethanol production from different poplar lines［J］.Bioresource Technology，2013，140：363－367.

［11］段曉健，居學海，張長波，等.酸堿結合預處理對水稻秸稈纖維素乙醇轉化率的影響［J］.化學與生物工程，2013，30（2）：83－86.

［12］李中陽，樊向陽，唐世榮，等.CO2濃度升高對不同品種水稻鎘吸收和根形態(tài)的影響［J］.應用生態(tài)學報，2012，23（4）：1063－1069.

［13］孟品佳，王繼芬，王燕燕，等.鴉片類毒品?；c硅烷化在GCMS分析中的比較［J］.化學試劑，2010，32（1），69－73.

［14］段曉健.楊樹和水稻秸稈木質纖維素乙醇轉化技術研究［D］.天津：天津師范大學，2013.

［15］周斌，張承明，張承聰，等.煙草中游離糖類的BSTFA 衍生化與氣相色譜－質譜聯用分析方法研究［J］.云南民族大學學報（自然科學版），2007，16（3）：239－242.

［16］CHEN M，ZHAO J，XIA L M.Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility［J］.Biomass ＆Bioenergy，2009，33（10）：1381－1385.

［17］凌吉廷，陳曉曄，蔣朱克，等.木質纖維素的預處理及應用［J］.糧油加工，2010，19（3）：119－123.

［18］王聲祥.GC－MS篩查尿中單糖及其在臨床診斷中的應用［D］.沈陽：中國醫(yī)科大學，2011.

［19］劉振華，王如偉，何厚洪，等.三甲基硅烷衍生化GC－MS研究延胡索中水溶性非生物堿類化學成分［J］.中國中藥雜志，2012，37（14）：2108－2112.

［20］王艷婷，徐正丹，彭良才.植物細胞壁溝槽結構與生物質利用研究展望［J］.中國科學：生命科學，2014，44（8）：766－774.

［21］蔡保松，張國平.大、小麥對鎘的吸收、運輸及在籽粒中的積累［J］.麥類作物學報，2002，22（3）：82－86.

［22］黃白飛，辛俊亮.植物積累重金屬的機理研究進展［J］.草業(yè)學報，2013，22（1）：300－307.

［23］陳魏.丙酮、乙醇預處理對稻草酶解糖化的影響研究［D］.重慶：重慶大學，2010.