桂海孌，金慶日，張亞軍，王曉杜，楊永春，邵春艷，程昌勇，衛(wèi)芳芳，楊楊，楊夢(mèng)華，宋厚輝

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基于熒光染料PicoGreen和核酸適配體的伏馬毒素B1檢測(cè)方法

桂海孌*，金慶日*，張亞軍，王曉杜，楊永春，邵春艷，程昌勇，衛(wèi)芳芳，楊楊，楊夢(mèng)華，宋厚輝

浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300

桂海孌, 金慶日, 張亞軍, 等. 基于熒光染料PicoGreen和核酸適配體的伏馬毒素B1檢測(cè)方法. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(9): 1393–1400.Gui HL, Jin QR, Zhang YZ, et al. Development of an aptamer/fluorescence dye PicoGreen-based method for detection of fumonisin B1. Chin J Biotech, 2015, 31(9): 1393–1400.

伏馬毒素B1是主要存在于玉米及玉米制品中的一種可以引起癌癥的霉菌毒素。針對(duì)霉菌毒素精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)對(duì)于保障食品安全至關(guān)重要。本研究利用核酸適配體與伏馬毒素B1結(jié)合后不再結(jié)合其互補(bǔ)核酸序列的選擇性以及PicoGreen與雙鏈DNA結(jié)合的特異性，開(kāi)發(fā)了一種快速檢測(cè)伏馬毒素B1的適配體方法。PicoGreen與雙鏈DNA反應(yīng)15 min后激發(fā)產(chǎn)生的熒光達(dá)到峰值 (激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm)。該方法的最低檢測(cè)限為0.1 μg/L (0.1 ppb)，線性范圍為0.1?1 μg/L (0.1?1 ppb)，整個(gè)檢測(cè)流程可在40 min內(nèi)完成。特異性試驗(yàn)顯示伏馬毒素B1適配體與黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等常見(jiàn)霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。結(jié)果表明適配體方法與基于抗體的檢測(cè)伏馬毒素B1商品化ELISA試劑盒相當(dāng)，Kappa值為0.857。由于核酸適配體比抗體成本低，檢測(cè)時(shí)間短，因此基于核酸適配體的方法比基于抗體的ELISA方法更具有推廣應(yīng)用價(jià)值。

伏馬毒素B1，核酸適配體，熒光染料，PicoGreen，檢測(cè)

伏馬毒素 (Fumonisin，F(xiàn)B) 是一種對(duì)嚙齒動(dòng)物具有致癌作用的真菌毒素，主要破壞肝腎功能[1]，誘發(fā)多種疾病，如馬腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫綜合癥[2]，已被證明對(duì)多種家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有害[3]。目前FB有11種，主要由輪狀、層狀鐮刀霉菌產(chǎn)生，其中FB1最常見(jiàn)[4]。FB1主要存在于玉米及玉米制品中，小麥、牛奶等食品及飼料易被污染[5]。世界衛(wèi)生組織對(duì)FB限量標(biāo)準(zhǔn)因各地的玉米及玉米制品的產(chǎn)量不同而異，美國(guó)食品與藥物管理局規(guī)定以玉米為原料的食品中 FB的最高限量為2 mg/kg，動(dòng)物飼料的限量范圍為1?50 mg/kg。

目前檢測(cè)FB1的方法主要是薄層色譜法[6]、高效液相色譜法[7]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)[8]等。這些方法對(duì)檢測(cè)儀器及操作人員要求較高，因此不宜進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；其中，基于抗體的ELISA方法所需的抗體制備繁瑣[9]，因此亟待建立一種快速檢測(cè)FB1的方法。

核酸適配體 (Aptamer) 是一種功能與抗體相似的單鏈寡核苷酸。經(jīng)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)[10]篩選得到的核酸適配體可與目標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合[11]，如蛋白質(zhì)[12]和藥物[13]等。核酸適配體可直接合成使用，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易修飾且無(wú)免疫原性[14]?，F(xiàn)已報(bào)道的基于核酸適配體的檢測(cè)方法有：磁珠法[15]、膠體金法[16]、熒光標(biāo)記法[17]等。

本文選用已報(bào)道的親和度最高的FB1特異性核酸適配體，利用非標(biāo)記熒光染料PicoGreen識(shí)別雙鏈核酸的特異性，建立了一種快速、高效檢測(cè)FB1的方法。該方法的原理[18]是：當(dāng)核酸適配體與FB1結(jié)合后，多余的、未結(jié)合FB1的核酸適配體可以與反應(yīng)體系中核酸適配體的互補(bǔ)鏈雜交生成雙鏈DNA。由于PicoGreen不結(jié)合單鏈核苷酸，僅識(shí)別并結(jié)合雙鏈DNA的螺旋溝，繼而可以釋放熒光信號(hào)[19]。當(dāng)不同濃度的FB1與特定濃度的核酸適體結(jié)合時(shí)，反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度不同，從而可以實(shí)現(xiàn)快速定量檢測(cè)FB1的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

96孔板購(gòu)自Conning公司 (Costar2592)；熒光檢測(cè)儀購(gòu)自BioTek公司 (Synergy? H1)；超純水儀購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司 (D11921)。

FB1、赭曲霉毒素A (Ochratoxin A，OTA)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)、桔毒素 (Citrinin，CTN) 和玉米赤霉烯酮 (Zearalenone，ZEN) 購(gòu)自Sigma公司；PicoGreen購(gòu)自Life Technologies公司 (P7581)；伏馬毒素ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Reagen公司 (RNM98009，檢測(cè)線性范圍：1?50 ppb)。

FB1核酸適配體 (FB139號(hào))[20]、核酸適配體互補(bǔ)鏈Seq1 (表1) 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

表1 本研究所用的寡核苷酸名稱與序列

1.2 檢測(cè)原理

PicoGreen是一種定量檢測(cè)雙鏈DNA的染料，靈敏度可達(dá)pg級(jí)，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光增強(qiáng)1 000倍以上，且不與單鏈DNA結(jié)合。當(dāng)FB1核酸適配體結(jié)合FB1后，適配體的空間構(gòu)象發(fā)生變化，不能再與其互補(bǔ)鏈Seq1結(jié)合。未與FB1結(jié)合的核酸適配體可與其互補(bǔ)鏈雜交形成雙鏈DNA。由此產(chǎn)生的雙鏈DNA可通過(guò)由PicoGreen檢測(cè)，通過(guò)熒光信號(hào)的變化確定樣品中的FB1濃度[21](圖1)。

1.3 PicoGreen檢測(cè)雙鏈核酸的反應(yīng)條件

所有反應(yīng)試劑以10 mmol/L Tris、120 mmol/LNaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl2(pH 8.5) 組成的緩沖液[22]為稀釋溶液。分別取50 μL 10 nmol/L核酸適配體與50 μL 10 nmol/L 互補(bǔ)鏈Seq1，于95 ℃變性5 min，靜置于冰上10 min[23]。將核酸適配體與互補(bǔ)鏈于孔內(nèi)混勻，于25 ℃反應(yīng)5 min[24]，再加入10 μL 10×PicoGreen溶液避光反應(yīng)，檢測(cè)熒光強(qiáng)度 (參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm)。

1.4 PicoGreen識(shí)別雙鏈DNA的時(shí)間優(yōu)化

取50 μL核酸適配體和50 μL互補(bǔ)鏈Seq1于孔內(nèi)混勻 (1∶1)，于25 ℃反應(yīng)5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen后立即放入熒光檢測(cè)儀內(nèi)，連續(xù)檢測(cè)30 min。

圖1 PicoGreen和適配體檢測(cè)FB1的原理圖

1.5 FB1檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)

將FB1稀釋成質(zhì)量濃度為0?1 μg/L的溶液，取50 μL FB1溶液與25 μL 20 nmol/L核酸適配體混勻，25 ℃反應(yīng)20 min，加入25 μL 20 nmol/L互補(bǔ)鏈Seq1溶液反應(yīng)5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen，混勻避光，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6 核酸適配體特異性試驗(yàn)

稀釋FB1、OTA、AFB1、CTN和ZEN質(zhì)量濃度為1 μg/L，分別取50 μL霉菌毒素溶液與25 μL 20 nmol/L FB1核酸適配體混勻，25 ℃反應(yīng)20 min，加入25 μL 20 nmol/L互補(bǔ)鏈Seq1溶液反應(yīng)5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen，混勻避光，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 檢測(cè)樣品試驗(yàn)

在含1%牛奶的溶液內(nèi)添加FB1，其中28份樣品內(nèi)含有FB1，濃度分別為1、2、2.5、5、10、50和100 μg/L (樣品重復(fù)數(shù)=4)，10份樣品無(wú)FB1，使用本文建立的方法檢測(cè)，計(jì)算實(shí)際檢測(cè)值與理論值的比值。同時(shí)用商品化的ELISA試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算Kappa值，并評(píng)估兩種方法是否一致。本研究方法：將樣品稀釋為 1 μg/L，取50 μL樣品溶液與25 μL 20 nmol/L核酸適配體混勻，25 ℃反應(yīng)20 min，加入25 μL 20 nmol/L互補(bǔ)鏈Seq1溶液反應(yīng)5 min，再加入10 μL 10×PicoGreen，混勻避光，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。ELISA檢測(cè)試劑盒操作方法：在包被有FB1抗原的微孔板中，每孔加入50 μL樣品溶液，再依次加入50 μL HRP標(biāo)記的二抗，50 μL FB1抗體，室溫孵育30 min，用300 μL洗滌緩沖液清洗3次，每孔加入100 μL TMB溶液，室溫孵育15 min，再加入100 μL終止液終止反應(yīng)，讀取450，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中OTA含量。計(jì)算ELISA方法和本試驗(yàn)建立的核酸適體-熒光染料檢測(cè)法之間的Kappa值[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PicoGreen對(duì)FB1核酸適配體形成的雙鏈DNA的檢測(cè)

建立基于PicoGreen和核酸適配體方法檢測(cè)FB1的前提是確定PicoGreen分別與適配體單鏈核苷酸、適配體和互補(bǔ)鏈之間形成的雙鏈核苷酸、緩沖液、FB1反應(yīng)后是否釋放熒光，該熒光是否可以被儀器識(shí)別并能用于后續(xù)的檢測(cè)。

結(jié)果顯示，核酸適配體與互補(bǔ)鏈Seq1的雜交產(chǎn)物雙鏈DNA結(jié)合PicoGreen后能夠釋放熒光信號(hào)，可以被熒光檢測(cè)儀捕捉。單鏈核苷酸或緩沖液本身不與PicoGreen結(jié)合，不能釋放出熒光信號(hào) (圖2)。這說(shuō)明PicoGreen和核酸適配體可以用于FB1毒素檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)。

圖2 FB1核酸適配體形成的雙鏈DNA與PicoGreen結(jié)合后的熒光檢測(cè)

2.2 PicoGreen釋放熒光峰值時(shí)間

PicoGreen結(jié)合雙鏈DNA后會(huì)被瞬間激發(fā)產(chǎn)生熒光，隨著時(shí)間推移熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，直到反應(yīng)體系中PicoGreen與雙鏈DNA的結(jié)合達(dá)到飽和為止。對(duì)于FB1特異性檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，加入反應(yīng)體系中的PicoGreen和核酸適配體濃度均為固定值，因此需要確定在特定濃度下熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值的時(shí)間。由圖3可知，反應(yīng)體系內(nèi)加入PicoGreen后，PicoGreen與FB1核酸適配體形成的雙鏈DNA結(jié)合后隨即釋放出熒光，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，熒光強(qiáng)度在15 min時(shí)趨于穩(wěn)定，并達(dá)到峰值。當(dāng)PicoGreen濃度固定時(shí)，熒光強(qiáng)度隨雙鏈DNA的增多而增強(qiáng)，直到PicoGreen完全結(jié)合雙鏈DNA為止。因此，在后續(xù)的檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)中，選擇15 min 作為PicoGreen與樣品的反應(yīng)時(shí)間。

2.3 基于核酸適配體的熒光檢測(cè)法檢測(cè)FB1的靈敏度

靈敏度又稱敏感性或最低檢測(cè)限，是檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。根據(jù)上述確定的最佳反應(yīng)時(shí)間，利用PicoGreen和核酸適配體方法對(duì)不同濃度的FB1進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在反應(yīng)體系中隨著FB1質(zhì)量濃度的增加，PicoGreen釋放的熒光強(qiáng)度逐漸減小 (圖4A)。這說(shuō)明FB1結(jié)合的核酸適配體增多，導(dǎo)致與后加入的互補(bǔ)鏈Seq1結(jié)合的核酸適配體減少，因此與PicoGreen結(jié)合的雙鏈DNA量減少，激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度減小。該方法的檢測(cè)下限為0.1 μg/L (0.1 ppb)，線性范圍為0.1?1 μg/L (0.1?1 ppb) (圖4B)。

圖3 PicoGreen與雙鏈DNA最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

圖4 FB1的靈敏度檢測(cè)

2.4 基于核酸適配體的熒光檢測(cè)法檢測(cè)FB1的特異性

特異性又稱交叉反應(yīng)性，是評(píng)價(jià)檢測(cè)技術(shù)好壞的一個(gè)重要標(biāo)志。為了證實(shí)本檢測(cè)技術(shù)采用的核心試劑FB1適配體和PicoGreen是否只能用于檢測(cè)FB1，不能和其他毒素發(fā)生交叉反應(yīng)。我們對(duì)食品中常見(jiàn)的霉菌毒素FB1、OTA、ZEN、CTN、AFB1進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，毒素質(zhì)量濃度相同時(shí)，PicoGreen檢測(cè)OTA、ZEN、CTN、AFB1反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度最大，而FB1反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度最小 (圖5)。這說(shuō)明在有FB1的反應(yīng)體系內(nèi)，核酸適配體與FB1發(fā)生了特異性結(jié)合，少量的核酸適配體與互補(bǔ)鏈Seq1結(jié)合，產(chǎn)生與PicoGreen結(jié)合的雙鏈DNA，因此激發(fā)產(chǎn)生少許熒光；其他毒素的反應(yīng)體系中的核酸適配體與互補(bǔ)鏈Seq1完全結(jié)合，產(chǎn)生大量雙鏈DNA，激發(fā)產(chǎn)生更多的熒光。即當(dāng)樣品中有FB1時(shí)，熒光強(qiáng)度較小，反之熒光強(qiáng)度較大。由此可知，本文選擇的核酸適配體可特異性識(shí)別并結(jié)合FB1，與OTA、AFB1、CTN或ZEN不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5 基于核酸適配體的熒光檢測(cè)法與ELISA試劑盒的一致性

為了比較基于核酸適體的熒光檢測(cè)法與基于抗體的商業(yè)化ELISA檢測(cè)試劑盒方法之間的符合度，以驗(yàn)證本方法檢測(cè)樣品的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)38份牛奶樣品進(jìn)行了檢測(cè)，計(jì)算出本方法的回收率 (表2)，低濃度條件下，回收率較低；當(dāng)濃度大于10 μg/L時(shí)，回收率高達(dá)99%。利用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算Kappa值為0.857 (檢測(cè)樣品濃度為0、1、2、2.5、5、10 μg/L)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性 (表3)，可用于樣品中FB1的檢測(cè)。

圖5 基于核酸適配體與PicoGreen檢測(cè)FB1的特異性試驗(yàn)

表2 基于ELISA和核酸適配體方法對(duì)牛奶樣品中FB1檢測(cè)的回收率比較

表3 基于核酸適配體的熒光檢測(cè)法與ELISA方法的Kappa值

+: positive; –: negative;=4

3 討論

食品安全問(wèn)題一直是世界關(guān)注的焦點(diǎn)，其中霉菌毒素污染最為常見(jiàn)。FB1主要污染玉米和玉米制品，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物的健康[26]。食品和飼料行業(yè)的檢測(cè)目前主要是免疫法和色譜分析法，存在設(shè)備與試劑昂貴、樣品處理繁瑣等不足之處[27]。

核酸適配體是完全不同于抗體的一種單鏈核苷酸，可形成莖環(huán)、發(fā)夾和G-四聚體 (G-quadruplex) 等結(jié)構(gòu)并與靶分子特異性結(jié)合，目前已被廣泛應(yīng)用于生物樣品的檢測(cè)[28]。

由本研究建立的基于核酸適配體的熒光檢測(cè)法選擇的FB1核酸適配體具有高特異性，與常見(jiàn)的霉菌毒素不發(fā)生交叉反應(yīng)。該熒光檢測(cè)法的檢測(cè)靈敏度為：0.1 μg/L，比商業(yè)化的檢測(cè)靈敏度高10倍 (美國(guó)Reagen公司，RNM98009，檢測(cè)靈敏度為：1.0 μg/L)。

本研究建立的檢測(cè)方法線性范圍0.1?1 μg/L是根據(jù)伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品 (純品) 進(jìn)行的檢測(cè)?；厥章适歉鶕?jù)人工污染牛奶樣品進(jìn)行的檢測(cè)。對(duì)于人工污染的樣品，需要利用甲醇萃取等步驟進(jìn)行回收，然后才能按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行FB1含量檢測(cè)。原始樣品中伏馬毒素含量越少，回收時(shí)損失越大。當(dāng)樣品中伏馬毒素含量超過(guò)10μg/L (μg/kg) 時(shí)，本方法的回收率可以達(dá)到97%以上，而國(guó)際上對(duì)食品和動(dòng)物性飼料中允許的最大殘留量分別是1 000?2 000 μg/kg，因此可以用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。所以本實(shí)驗(yàn)針對(duì)的原始樣品中伏馬毒素的回收率是符合要求的，檢測(cè)線性范圍和回收率不矛盾。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，當(dāng)樣品中FB1含量超過(guò)1 μg/L時(shí)，需要將樣品稀釋到線性范圍內(nèi)。

本研究建立的基于核酸適配體與熒光染料PicoGreen的新方法將反應(yīng)體系內(nèi)未知濃度的FB1轉(zhuǎn)換為可以定量檢測(cè)的熒光信號(hào)，達(dá)到檢測(cè)FB1的目的，特異性強(qiáng)，靈敏度高。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在40 min內(nèi)完成，具備快速、易操作的特點(diǎn)。本研究建立的基于核酸適配體與PicoGreen檢測(cè)FB1的方法為霉菌毒素的檢測(cè)提供了新的思路，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Development of an aptamer/fluorescence dye PicoGreen-based method for detection of fumonisin B1

Hailuan Gui*, Qingri Jin*, Yajun Zhang, Xiaodu Wang, Yongchun Yang, Chunyan Shao, Changyong Cheng, Fangfang Wei, Yang Yang, Menghua Yang, and Houhui Song

College of Animal Science and Technology, Zhejiang A&F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China

Fumonisin B1(FB1) is a carcinogenic mycotoxin found in commodities such as corn and corn-originated products. An aptamer-based method for detection of FB1was developed using the fluorescent dye PicoGreen, which can recognize and bind double-stranded DNA. A peak fluorescence of PicoGreen was obtained in 15 min in the presence of FB1aptamer, which formed a double-stranded hybridizer DNA with its complementary strand. The excitation and emission wavelengths for PicoGreen detection were 480 nm and 520 nm, respectively. The sensitivity of this aptamer/PicoGreen-based method was 0.1 μg/L. This method showed a good linearity for FB1concentration ranging from 0.1 to 1 μg/L. The entire detection procedure for FB1could be completed within 40 min. No cross reactions were observed with any other mycotoxins against aflatoxin B1, ochratoxin A, citrinin and zearalenone, demonstrating high specificity towards FB1aptamer. Agreement between commercial, antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit and aptamer method was excellent with a kappa value of 0.857. Taken together, this aptamer/PicoGreen-based method is more cost-effective, time-saving and useful than ELISA for detection of FB1.

fumonisin B1, aptamer, fluorescent dye, PicoGreen, detection

10.13345/j.cjb.140590

November 30, 2014; Accepted: January 30, 2015

National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA101602), Project Supported by Zhejiang Province University Student Science and Technology Innovation Plan (Fresh Talent Program) (No. 2014R412040), Zhejiang A&F University Talent Starting Program (Nos. 2011FR025, 2013FR012, 2012FR047, 2013FR076, 2013FR054).

Houhui Song. Tel: +86-571-63741392; Fax: +86-571-63741731; E-mail: songhh@zafu.edu.cn Menghua Yang. Tel: +86-571-63741392; Fax: +86-571-63741731; E-mail: yangmh@zafu.edu.cn

*These authors contributed equally to this study.

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA101602)，浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃 (新苗人才計(jì)劃) (No. 2014R412040)，浙江農(nóng)林大學(xué)人才啟動(dòng)項(xiàng)目 (Nos. 2011FR025, 2013FR012, 2012FR047, 2013FR076, 2013FR054) 資助。

2015-03-25

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150325.1129.006.html