王林果馬 軍

(1.普萊柯生物工程股份有限公司,河南洛陽(yáng) 537000; 2.海南大學(xué),海南三亞 570225)

雛雞關(guān)節(jié)炎病原菌株分離鑒定及藥敏性分析

王林果1馬 軍2

(1.普萊柯生物工程股份有限公司,河南洛陽(yáng) 537000; 2.海南大學(xué),海南三亞 570225)

根據(jù)雞胚孵化周期,對(duì)南方某公司提供的雞胚及發(fā)病小雞進(jìn)行連續(xù)21d細(xì)菌調(diào)查,分別從雞胚的蛋清、蛋殼、死胚內(nèi)物質(zhì)、死胚的肝及關(guān)節(jié)、發(fā)病小雞的肝及關(guān)節(jié)中分離可疑細(xì)菌,并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯,培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)菌分離;采用生化特征法鑒定出三種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分別為大腸桿菌、沙門氏菌及弗勞地氏枸掾酸桿菌。采用K-B法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn),結(jié)果顯示三種菌株對(duì)復(fù)達(dá)欣、先鋒V、鏈霉素、慶大霉素、阿莫西林的敏感性達(dá)100%;對(duì)氯霉素、四環(huán)素的敏感性達(dá)75%;對(duì)利福平、萘啶酸的敏感性達(dá)25%。結(jié)果表明,對(duì)雞的細(xì)菌性疾病,采取預(yù)防措施,對(duì)癥下藥是提高經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素。

雞胚;分離;鑒定;藥敏實(shí)驗(yàn)

2014年11月中旬，南方某公司孵化場(chǎng)自行孵化的幾批次三黃雞雛雞1～10日齡大量雞跛行，并伴有死亡現(xiàn)象，死亡率較高。場(chǎng)方采用添加多種維生素，復(fù)合維生素B并用抗菌藥物治療，能較好控制病情繼續(xù)發(fā)展。為搞清楚導(dǎo)致這幾批次雛雞發(fā)病的病原，從根本上找到原因解決它，筆者設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)病原展開調(diào)查，現(xiàn)將其結(jié)果匯報(bào)如下文。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 收集監(jiān)測(cè)材料

活雞胚，死胚，發(fā)病小雞及死亡小雞。

1.1.2 主要儀器及藥品

生化培養(yǎng)箱，電子天平，光學(xué)顯微鏡，潔凈工作臺(tái)，腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)微量鑒定管，藥敏鑒定試紙，革蘭氏染色試劑盒，緩沖蛋白胨水（BPW），XLD培養(yǎng)基及胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基（TSEA），鑒定培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌調(diào)查

取雞胚的蛋清、蛋殼，死胚的內(nèi)物質(zhì)或死胚的肝及關(guān)節(jié)，小雞的肝及關(guān)節(jié)接種于BPW培養(yǎng)基中，于37℃恒溫溫箱培養(yǎng)24h；取BPW培養(yǎng)基培養(yǎng)物分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、XLD瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h進(jìn)行細(xì)菌調(diào)查[1]，記錄細(xì)菌的感染情況，并計(jì)算每天每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的細(xì)菌感染率。

1.2.2 生化鑒定

生化鑒定項(xiàng)目包括以下項(xiàng)目：糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)、氨基酸類試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、苯丙氨酸試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)。具體操作方法按照說明書進(jìn)行，記錄結(jié)果根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定分離的細(xì)菌。

1.2.3 病原細(xì)菌的生物學(xué)特性研究

（1）培養(yǎng)特性 取純培養(yǎng)物分別接種于XLD平板、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基（TSEA），37℃培養(yǎng)18～24h觀察其培養(yǎng)特性。

（2）革蘭氏陽(yáng)性、陰性染色

1.2.4 病原細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)

按NCCLS抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)M2-A8標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采用的菌種都已經(jīng)經(jīng)過分離鑒定。取分離純化的四株菌做藥敏實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其耐藥性。藥敏實(shí)驗(yàn)按K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，將四株菌株接種于1.5mlBPW培養(yǎng)基的EP管中，置于37℃溫箱中培養(yǎng)18h[2]，菌液與滅好菌的0.9%生理鹽水按1：1000稀釋，在普通瓊脂平板上均勻涂布，蓋上平板，置室溫?cái)?shù)分鐘至培養(yǎng)基表面無明顯液體，用無菌小鑷子夾取藥敏紙片平貼于瓊脂平板表面，然后翻轉(zhuǎn)倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌環(huán)直徑并判定。以上所有菌株均做兩個(gè)重復(fù)。把抑菌圈直徑的大小作為判定藥物敏感性的高低的標(biāo)準(zhǔn)，采用WHO質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌的敏感性及抑菌環(huán)大小，采用劃分方式報(bào)告結(jié)果，即敏感、中度敏感和耐藥（見表1）。

表1 具體判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌感染率調(diào)查結(jié)果

表2 各項(xiàng)目細(xì)菌感染率調(diào)查表

由表2可看出，每天隨機(jī)抽取的雞胚中，殼的染菌率較高，在50～100%之間浮動(dòng)；根據(jù)雞胚孵化的生理時(shí)間，對(duì)雞胚的細(xì)菌調(diào)查分兩階段，第一階段中蛋清部分被染菌，感染率在0～28.6%之間，而蛋黃都未被染菌，第二階段雞胚初步成型，染菌率為0～10%之間；死的雞胚中染菌率也較高，在抽取的生長(zhǎng)緩慢或帶病小雞中，肝和關(guān)節(jié)的染菌率，分別為20～100%和10～100%；由此可知，殼、死雞胚及小雞的肝、關(guān)節(jié)的染菌率較高，雞胚殼上的細(xì)菌通過種雞的排泄物進(jìn)行水平傳播，雞胚及死雞胚中的細(xì)菌通過種雞垂直傳播，而小雞則是通過飲食或周圍環(huán)境，水平傳播或垂直傳播。

圖1 各項(xiàng)目細(xì)菌分離率曲線圖

2.2 病原分離結(jié)果

從雞胚殼及雞胚分離出的可疑細(xì)菌菌落形態(tài)各異（見圖2），圖中（a）、（d）分別為第5d、17d從雞胚殼上分離出的可疑細(xì)菌，菌體黃色，圓形濕潤(rùn)，有光澤，不透明；（b）為第11d從雞胚殼上分離出的可疑細(xì)菌，平板上方及左下方菌體黃色，圓形濕潤(rùn)，有光澤，不透明，右下方菌體黑色圓形，有光澤，不透明；（c）為第14d從雞胚內(nèi)分離出的可疑細(xì)菌，菌體黑色圓形，無光澤，不透明。

圖2 雞胚殼及雞胚分離出的細(xì)菌菌落形態(tài)

2.2.1 三種細(xì)菌在XLD選擇性培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

將從雞胚殼及雞胚分離出的可疑細(xì)菌接到XLD選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，24h后觀察其形態(tài)（見圖3.2），（a）為細(xì)菌A在此培養(yǎng)基上發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，在酚紅中呈黃色，菌體圓形濕潤(rùn)，有光澤，不透明；（b）為細(xì)菌B與培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉產(chǎn)生H2S，故呈黑色，菌體圓形濕潤(rùn)，有光澤，不透明；（c）為細(xì)菌C發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，又與培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉產(chǎn)生H2S，故菌在培養(yǎng)中黑而不亮，表面有一層黃色，邊緣也呈黃色。

圖3 三種細(xì)菌在XLD選擇性培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2.2 三種細(xì)菌在胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

將從雞胚殼及雞胚分離出的可疑細(xì)菌接到胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，24h后觀察其形態(tài)（見圖4），圖中（a）為細(xì)菌A，菌體乳白色，圓形濕潤(rùn)，有光澤，半透明；（b）為細(xì)菌B，菌體乳白色，圓形濕潤(rùn)，有光澤，不透明，菌落直徑較小，（c）為細(xì)菌C，菌體形態(tài)與細(xì)菌B相似。

圖4 三種細(xì)菌在胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.3 細(xì)菌菌體形態(tài)

對(duì)所分離的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，三種細(xì)菌鏡檢結(jié)果都為革蘭氏陰性，圖5為細(xì)菌A，其菌體形態(tài)兩極鈍圓，短桿狀；圖5細(xì)菌B的菌體形態(tài)細(xì)桿狀，散亂分布；圖5 細(xì)菌C的菌體形態(tài)桿狀，且較粗短，均勻分布。

圖5 細(xì)菌A、B、C菌體光鏡下形態(tài).

2.4 細(xì)菌的生化鑒定

2.4.1 細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果

表3 生化鑒定結(jié)果

2.4.2 三種細(xì)菌的鑒定結(jié)果

菌A鑒定值為AG440，鑒定結(jié)果為大腸埃希氏菌；菌B鑒定值為AG710，鑒定結(jié)果為沙門氏菌；菌C鑒定值為AG110，鑒定結(jié)果為弗勞地氏枸櫞酸桿菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)

三種菌株的藥敏試驗(yàn)，18～24h的試驗(yàn)結(jié)果（見圖6）

三種菌株的藥敏試驗(yàn)，18～24h的試驗(yàn)結(jié)果（見圖6）

2.5.1 不同藥物對(duì)不同菌株的抑菌直徑

2.5.2 三株菌株對(duì)20種藥物的耐藥與敏感情況

3 分析與討論

3.1 對(duì)細(xì)菌性疾病的預(yù)防措施

圖6 三種菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表4 三株菌株的抑菌直徑（單位：mm）

表1的調(diào)查數(shù)據(jù)表明，殼、死雞胚及小雞的肝、關(guān)節(jié)的染菌率較高，雞胚殼上的細(xì)菌通過種雞的排泄物進(jìn)行水平傳播，雞胚及死雞胚中的細(xì)菌通過種雞垂直傳播，而小雞則是通過飲食或周圍環(huán)境，水平傳播或垂直傳播，從而導(dǎo)致雞的孵化率低、雞生長(zhǎng)緩慢、跛腳甚至死亡等病癥，因此疫病的綜合性防制和營(yíng)造良好的飼養(yǎng)環(huán)境就成為了養(yǎng)雞業(yè)控制大腸桿菌病的關(guān)鍵所在。我們僅從飲水、飼料和雞舍這三個(gè)方面就輕而易舉地說明道理：飲水極易腐敗變質(zhì)，通常養(yǎng)雞場(chǎng)使用的是貯水式給水器和罐式飲水器，在混入的飼料、塵埃和雞的唾液等污物的污染下，通常-晝夜細(xì)菌會(huì)增殖百萬(wàn)倍，尤其是夏季和雞舍內(nèi)溫度較高的情況下，以及在飲水中添加營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)（如維生素等）。在飼料中反映出的問題更為嚴(yán)重，本來大腸桿菌對(duì)抗生素類藥品就有較強(qiáng)的抗藥性，但現(xiàn)在的-些飼料生產(chǎn)企業(yè)濫加抗生素，使病原微生物產(chǎn)生的抗藥性給預(yù)防和治療都帶來極大的困難[3]。另外，飼料廠在生產(chǎn)中原材料品質(zhì)較差，劣質(zhì)的原料（魚粉、骨粉、羽毛粉、血粉等）帶入大量的致病菌。雞舍的環(huán)境衛(wèi)生不好，就可給大腸桿菌的繁衍創(chuàng)造更加良好的條件。在這種情況下諸如濕度、溫度、灰塵、酸堿度發(fā)生改變時(shí)[4]，當(dāng)飼養(yǎng)水平低下時(shí)病雞就會(huì)源源不斷地出現(xiàn)，因此，應(yīng)做到以下預(yù)防：

（1）防止水源的污染，注意飲水的衛(wèi)生和消毒，這是預(yù)防本病的重要方面。水槽要經(jīng)常清洗，必要時(shí)可在飲水中加入適當(dāng)濃度的消毒藥，以殺滅飲水中的病源微生物，不但對(duì)大腸桿菌病，對(duì)其他-些疾病也有較好的預(yù)防作用。

表5 三株菌株的藥物敏感度

（2）種雞場(chǎng)要及時(shí)收撿種蛋，避免種蛋被糞便污染，在孵化前做好種蛋細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)，凡被糞便污染的種蛋，一律不得做孵化。

（3）搞好種蛋、孵化器及孵化全過程的清潔衛(wèi)生及消毒工作，以減少雛雞感染大腸桿菌病和大腸桿菌病的傳播。

（4）注意育雛期間的飼養(yǎng)管理，保持較穩(wěn)定的溫度、濕度，做好飼養(yǎng)管理用具的消毒衛(wèi)生。

（5）控制雞群的飼養(yǎng)密度，防止過分擁擠，保持空氣流通、新鮮，防止有害氣體污染，定期消毒雞舍、用具及養(yǎng)雞環(huán)境。

3.2 對(duì)細(xì)菌性關(guān)節(jié)病的治療

對(duì)細(xì)菌性關(guān)節(jié)病的治療，最好是做藥敏試驗(yàn)后再用藥。因時(shí)間及條件限制時(shí)，可選用幾種對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌都敏感的藥物試用[5]。對(duì)重度跛行雞全部淘汰，對(duì)10～30日齡的輕度跛行雛雞肌注卡那霉素，每只5千至1萬(wàn)單位，經(jīng)處理后，可以使淘汰病雞數(shù)量隨之減少，但確切有效的方法還有待在生產(chǎn)研究中不斷發(fā)現(xiàn)，不斷完善。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)雞沙門氏菌可引起雞關(guān)節(jié)炎。沙門氏菌傳播的方式有：①經(jīng)口感染，如通過飼料或飲水；②能垂直傳遞和水平傳播，受感染種蛋，出雛后進(jìn)橫向傳播給同群雞，因幼齡雛雞敏感，故這一途徑極為重要；③間接感染，哺乳動(dòng)物（包括人），鳥和昆蟲等均可為傳染源，其中特別重要的使老鼠和甲蟲，它們會(huì)將病源從一群傳播到另一群。因此要對(duì)沙門氏菌達(dá)到有效防治，就要做到以下幾點(diǎn)：①加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，如飼料飲水的控制管理，環(huán)境對(duì)健康雞腸道菌群的構(gòu)成起決定作用，控制雞白痢等疾病應(yīng)注意環(huán)境的凈化[6]；②從種雞場(chǎng)開始，采用有計(jì)劃的檢疫淘汰和綜合防治相結(jié)合的方法進(jìn)行凈化；③培育無雞白痢沙門氏菌的種雞群以切斷由蛋循環(huán)傳遞的鏈鎖[7-8]；④消滅傳染源，逐步控制和消滅此病。

3.3 耐藥性的控制

本試驗(yàn)表4、表5的藥敏結(jié)果顯示在雞胚殼上及死雞胚內(nèi)分離出的四個(gè)菌株對(duì)甲氧胺嘧啶耐藥率達(dá)100%；對(duì)利福平、萘啶酸的耐藥率達(dá)75%；對(duì)氯霉素、四環(huán)素耐藥率為25%；對(duì)復(fù)達(dá)欣、先鋒V、鏈霉素、慶大霉素、阿莫西林的敏感性達(dá)100%；對(duì)氯霉素、四環(huán)素的敏感性達(dá)75%；對(duì)利福平、萘啶酸的敏感性達(dá)25%。可見菌株的耐藥性達(dá)到-個(gè)相當(dāng)?shù)某潭?。?duì)于該病的控制目前我國(guó)各地主要通過使用抗菌藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，但是抗菌藥物的使用不當(dāng)或?yàn)E用，不僅使成本上升，而且?guī)砹四退幮缘?系列問題。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究表明，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理包括：與抗生素結(jié)合靶位改變，使抗生素與細(xì)菌親和力下降，從而使抗生素失活或活性下降；細(xì)胞膜通透性的改變，使抗生素進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)量減少；R質(zhì)粒在細(xì)菌間穿梭，可將耐藥基因傳入不同的細(xì)菌，使細(xì)菌獲得耐藥性。

造成耐藥性的原因有很多，如養(yǎng)殖戶用藥過程中選藥、劑量、療程不當(dāng)，甚至有不少專業(yè)戶常常在未確定病因的情況下，大量使用廣譜抗菌藥，存在嚴(yán)重濫用藥物現(xiàn)象[9]；假冒偽劣獸藥產(chǎn)品充斥市場(chǎng)，個(gè)別獸藥廠家的產(chǎn)品有效成分含量不足，名牌中標(biāo)記的劑量、療程常不能達(dá)到治療效果，對(duì)養(yǎng)殖戶的用藥起到嚴(yán)重的誤導(dǎo)作用。其中最主要的養(yǎng)殖戶不規(guī)范使用或?yàn)E用抗生素，使得很多耐藥菌株的產(chǎn)生。

要有效控制耐藥性的產(chǎn)生，就要做到以下幾點(diǎn)：①在治療過程中，做藥敏實(shí)驗(yàn)篩選高敏感藥物，增加了選藥、劑量、療程的準(zhǔn)確性；②在養(yǎng)殖專業(yè)戶和養(yǎng)殖場(chǎng)工作人員中進(jìn)行宣傳教育，使其加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，合理用藥，特別是合理使用抗生素；③制定相關(guān)的法律法規(guī)，對(duì)于制造假冒偽劣獸藥產(chǎn)品，誤導(dǎo)群眾的廠家進(jìn)行嚴(yán)厲打擊，加大力度規(guī)范獸藥市場(chǎng)。

4 結(jié)論

（1）本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌感染調(diào)查數(shù)據(jù)表明，雞胚殼上的染菌率最高，死雞胚及小雞的肝、關(guān)節(jié)的染菌率次之。分別從第17d的雞胚殼上、第11d的雞胚殼上及第14d的死雞胚內(nèi)分離出的細(xì)菌A、細(xì)菌B及細(xì)菌C，經(jīng)鏡檢及生化鑒定，鑒定出細(xì)菌A為大腸桿菌，細(xì)菌B為沙門氏菌，細(xì)菌C為弗勞地氏枸櫞酸桿菌（C.freundii）。

（2）藥敏結(jié)果顯示三個(gè)菌株對(duì)甲氧胺嘧啶耐藥率達(dá)100%；對(duì)利福平、萘啶酸的耐藥率達(dá)75%；對(duì)氯霉素、四環(huán)素耐藥率為25%；對(duì)復(fù)達(dá)欣、先鋒V、鏈霉素、慶大霉素、阿莫西林的敏感性達(dá)100%；對(duì)氯霉素、四環(huán)素的敏感性達(dá)75%；對(duì)利福平、萘啶酸的敏感性達(dá)25%。

[1] 李鍵強(qiáng)，李六金.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 陜西：科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[2] 劉媚，曹文匯，白芳等. 雞大腸桿菌和沙門氏菌混合感染的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)研究[J] .獸醫(yī)研究，2007，（213）：14-16.

[3] 石優(yōu)章，徐霞芬，何水淵等.76株沙門氏菌菌型鑒定與耐藥性檢測(cè)[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，1998，（6）：383.

[4] 溫群文，袁夢(mèng)，俞幕華等. 三種方法檢測(cè)沙門氏菌的比較研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6（11）：1960-1961.

[5] 任廣蓮.淺談雞白痢病的凈化與防治[J].禽業(yè)科技，1998，14（2）：47.

[6] 代玉林.沙門氏菌的綜合控制措施[J] .肉類工業(yè)，2003，（11）：35-36.

王林果（1978-），男，禽病學(xué)博士，普萊柯生物工程股份有限公司，獸醫(yī)師。