楊靜毅，喻玲玲,2,*，吳 梅，劉紀(jì)成，張雨杰，江 凱，王 畢

銀合歡果皮總黃酮含量測(cè)定及抗氧化活性

楊靜毅1，喻玲玲1,2,*，吳 梅1，劉紀(jì)成1，張雨杰1，江 凱1，王 畢1

（1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002）

目的：建立測(cè)定銀合歡果皮中總黃酮含量的方法，研究其體外抗氧化活性。方法：運(yùn)用NaNO2-Al(NO3)3顯色法，檢測(cè)總黃酮含量，并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和還原力分析其抗氧化活性。結(jié)果：蘆丁在0.01～0.05 mg/mL（r=0.999 1）質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度之間呈良好線性關(guān)系，平均回收率為99.35%（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%），總黃酮含量為1.76 mg/g；銀合歡果皮具有顯著的抗氧化活性，且呈劑量依賴性，其抑制DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.32 mg/mL，還原力IC50為70.12 μg/mL。結(jié)論：所建立的方法簡單快捷、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，適合銀合歡果皮中總黃酮含量的測(cè)定。銀合歡果皮中含有豐富的黃酮類化合物，且具有良好的體外抗氧化活性。

銀合歡果皮；黃酮；抗氧化活性

銀合歡（Leucaena leucocephala (Lam.) de Wait）又名白合歡，為多年生豆科木本植物，廣泛分布于熱帶亞熱帶地區(qū)，在我國南部分布很廣[1]。銀合歡生長快，適應(yīng)性強(qiáng)，是荒山綠化的先鋒樹種。葉片干物質(zhì)中粗蛋白質(zhì)含量達(dá)22%～29%，還含有豐富的氨基酸、胡蘿卜素、多種維生素和微量元素，其枝葉和豆莢都是牛、羊的好飼料，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織的飼料專家譽(yù)為“蛋白質(zhì)倉庫”[2]。銀合歡葉具有清熱解毒、消食解渴開胃的功效，在海南及廣西民間，銀合歡葉可作為保健茶泡飲，其保健作用與茶葉相當(dāng)，并且不含咖啡因[3]。

文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，銀合歡葉和種子中主要含有黃酮、生物堿、萜類、香豆素、甾體和脂肪酸類化合物[4-14]。在廣西壯族民間銀合歡種子可用于治療糖尿病[15]，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)銀合歡種子和葉均具有顯著的降血糖、保肝、抑菌、利尿等活性，且其主要的有效成分為黃酮[16-24]。黃酮是具有較強(qiáng)清除自由基和抗氧化能力的一種物質(zhì)，而黃酮因其結(jié)構(gòu)不同以及含量不同，有的表現(xiàn)出生物活性，有的則沒有生物活性[25-27]。姜建輝等[28]測(cè)得銀合歡葉中總黃酮含量為2.05%。

綜上所述，目前關(guān)于銀合歡的研究大多集中于其葉和種子，而針對(duì)其果皮的研究鮮有報(bào)道，為更加充分利用銀合歡資源，對(duì)其果皮進(jìn)行化學(xué)成分 及藥理活性研究非常有必要。如果能夠?qū)︺y合歡果皮進(jìn)行開發(fā)利用，不僅能夠保護(hù)環(huán)境，還能使資源利用最大化，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)銀合歡果皮中總黃酮的含量測(cè)定方法和抗氧化活性進(jìn)行研究，擬建立銀合歡果皮中總黃酮的含量測(cè)定方法，同時(shí)對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行探討，為銀合歡果皮的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀合歡果皮采自云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院陳發(fā)菊教授鑒定為豆科含羞草亞科銀合歡屬銀合歡的果皮。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：161985） 華順生物技術(shù)有限公司；其余所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210S電子分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；DZF-2B真空減壓干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；WGL-65B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；SZ-93自動(dòng)雙重水蒸餾器 上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[29-30]

精密稱取在120 ℃條件下減壓干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得0.1 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。精密取對(duì)照品溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于6 個(gè)5 mL容量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液0.15 mL，混勻，放置6 min；加10% Al(NO3)3溶液0.15 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH溶液2 mL，再加甲醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。用酶標(biāo)儀于波長510 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

銀合歡果皮粉末0.046 g，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液超聲提取3 次，每次0.5 h。過濾、濃縮，加入甲醇溶解，制成1 mg/mL供試品溶液。精密取供試品溶液1 mL按1.3.1節(jié)方法測(cè)定其總黃酮含量。

1.3.3 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法測(cè)定抗氧化活性[31-32]

用無水乙醇定容VC，配成1.58 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用乙醇稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取60 μL待測(cè)液標(biāo)準(zhǔn)溶液，加60 μL 1 mmol/L DPPH乙醇溶液，充分混合，室溫避光靜置30 min，于波長517 nm處測(cè)其吸光度（A實(shí)驗(yàn)）。對(duì)照組用60 μL無水乙醇代替DPPH溶液（A對(duì)照），空白組用60 μL無水乙醇代替樣品（A空白），各組平行測(cè)定3 次，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.4 還原能力的測(cè)定[33-34]

準(zhǔn)確稱取33 mg銀合歡果皮粉末，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液定容至10 mL，配成3.3 mg/mL的待測(cè)液。在1.5 mL Ep管中分別加入不同質(zhì)量濃度待測(cè)液100 μL，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）100 μL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液100 μL，置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液100 μL，搖勻。吸取上清液50 μL，在96孔板中加入50 μL蒸餾水和50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%三氯化鐵溶液。VC為對(duì)照品，樣品在波長700 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長的選擇

按照1.3節(jié)方法制備樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在波長300～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，樣品溶液和對(duì)照品溶液在波長510 nm處均有最大吸收，由此確定檢測(cè)波長為510 nm。

2.2 線性范圍

按照1.3.1節(jié)所述方法用酶標(biāo)儀測(cè)定不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液的吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：A = 6.348C＋0.009 8，r = 0.999 1。結(jié)果表明蘆丁在0.01～0.05 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度間呈良好線性關(guān)系。

2.3 精密度

精密取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液1.00 mL，連續(xù)測(cè)定5 次，記錄吸光度，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.78%，表明精密度良好，結(jié)果見表1。

表 1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.4 穩(wěn)定性

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的銀合歡果皮粉末0.046 g，按1.3.2節(jié)方法制備樣品溶液，室溫條件下放置，分別于0、0.5、1、2、3 h測(cè)定吸光度，樣品的吸光度RSD為0.47%，表明樣品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表 2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Stability of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.5 重復(fù)性

精密稱取5 份干燥至恒質(zhì)量的銀合歡果皮粉末，按1.3.2節(jié)方法制備樣品溶液，測(cè)定其吸光度，樣品的吸光度RSD為1.33%，表明該方法有良好的重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表 3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repeatability of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.6 加樣回收率

精密稱取5 份已知含量（1.76 mg/g）的銀合歡果皮粉末，每份加入蘆丁對(duì)照品0.040、0.080、0.120、0.160、0.200 mg，按照1.3.2節(jié)方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算回收率，蘆丁的平均回收率為99.35%，RSD為1.37%。結(jié)果表明總黃酮回收率良好，方法準(zhǔn)確性高，具有可行性，具體結(jié)果見表4。

表 4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability of the spectrophotometric method forTable 4 Repeatability of the spectrophotometric method for determination of total flavonoids ds

2.7 銀合歡果皮中總黃酮含量

按照1.3.2節(jié)方法制備5 份供試品溶液，按1.3.1節(jié)方法測(cè)定其吸光度，由回歸方程計(jì)算含量。5 批銀合歡果皮中總黃酮的平均含量為1.76 mg/g。

2.8 銀合歡果皮的抗氧化能力

對(duì)銀合歡果皮清除DPPH自由基的能力進(jìn)行研究，由圖1可知，銀合歡果皮對(duì)DPPH自由基具有顯著的清除作用，其清除能力隨樣品質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)（半數(shù)抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）為0.32 mg/mL），但銀合歡果皮清除DPPH自由基的能力弱于陽性對(duì)照VC（IC50為0.01 mg/mL）。

圖 1 銀合歡果皮對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical-scavenging capacity of L. leucocephala fruit peel

2.9 銀合歡果皮的還原能力

抗氧化劑的抗氧化能力與其還原力有關(guān)，還原力越大，抗氧化能力越強(qiáng)。反應(yīng)物的吸光度增加表明還原力增強(qiáng)。由圖2可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，樣品的吸光度明顯上升，表明還原能力逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。IC50為70.12 μg/mL的銀合歡果皮提取物的還原力與IC50為7.74 μg/mL的VC相當(dāng)。

圖 2 銀合歡果皮還原能力Fig.2 Reducing power of L. leucocephala fruit peel

3 結(jié) 論

銀合歡作為營養(yǎng)保健型的綠色食品，日益受到人們的關(guān)注，其研究和開發(fā)也在逐步深入。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用NaNO2-Al(NO3)3顯色法對(duì)銀合歡果皮中總黃酮含量測(cè)定進(jìn)行相關(guān)的探索，建立含量測(cè)定方法操作合理簡單，方法精密度高，重復(fù)性及線性關(guān)系良好，回收率高，可為銀合歡的質(zhì)量控制提供研究基礎(chǔ)。

目前關(guān)于銀合歡果皮的藥理活性鮮有報(bào)道，本研究探討其體外抗氧化活性，銀合歡果皮清除DPPH自由基的IC50為0.32 mg/mL，還原力的IC50為70.12 μg/mL，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。而關(guān)于其總黃酮含量與抗氧化活性間的相關(guān)性，還有待進(jìn)一步的研究。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì). 中國植物志: 第39卷[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2006: 18.

[2] 趙英, 陳小斌, 蔣昌順. 我國銀合歡研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 26(4): 55-58.

[3] 王強(qiáng), 王恩舉, 迪麗菲嘎兒, 等. 銀合歡葉成分槲皮素-3-O-鼠李糖苷FT-IR和FT-Raman光譜[J]. 光散射學(xué)報(bào), 2000, 12(1): 27-29.

[4] HASSAM R A, TAWFIK W A, ABOU-SETTA L M. The flavonoid constitunts of Leucaena leucocephala. Growing in Egypt, and their biological activity[J]. African Journal of Traditional, Complementary, and Alternative Medicines, 2013, 11(1): 67-72.

[5] SALEM A Z M, SALEM M Z M, RONQUILLO M G, et al. Major chemical constituents of Leucocephala and Salix babylonica leaf extracts[J]. Journal of Tropical Agriculture, 2011, 49(1/2): 95-98.

[6] CHEN C Y, WANG Y D. Steroids from the whole plants of Leucaena leucocephala[J]. Ameciran Journal of Analytical Chmistry, 2010, 1: 31-33.

[7] MOHAMED E A, KHADIGA A A. Chemical composition and amino acids profile of Leucaena leucocephala seeds[J]. International Journal of Poultry Science, 2009, 8(10): 966-970.

[8] 候小濤, 鄧家剛, 周江煜, 等. 銀合歡葉的化學(xué)成分研究[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2012, 27(6): 610-612.

[9] 王恩舉, 梁德華, 楊智藴. 銀合歡葉黃酮類成分的研究[J]. 海南師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 21(2): 171-172.

[10] CHEN C Y, WANG Y D. Polyprenol from the whole plants of Leucaena leucocephala[J]. Journal of Environmental Protection, 2010, 1: 70-72.

[11] CHEN C Y, WANG Y D. Secondary metabolites from Leucaena leucocephala[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2011, 47(1): 145-146.

[12] 李學(xué)堅(jiān). 銀合歡葉的化學(xué)成分及藥理活性研究[D]. 南寧: 廣西中醫(yī)學(xué)院, 2005: 5-21.

[13] 李學(xué)堅(jiān), 林立波, 鄧家剛, 等. 銀合歡葉揮發(fā)油色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用分析[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2005, 16(2): 96-97.

[14] 張臻, 周媛, 鄒坤. ICP-MS法測(cè)定銀合歡種和種皮中27 種金屬元素含量[J]. 三峽大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版[J]. 2012, 34(6): 106-109.

[15] 廣西重要資源普查辦公室. 廣西中藥資源名錄[M]. 南寧: 廣西民族出版社, 1993: 120.

[16] UMAH R K, BACANI A, NOORIZA A, et al. Leucaena leucocephala fruit aqueous extract stimulates adipogenesis, lipolysis, and glucose uptake in primary rat adipocytes[J]. The Scientific World Journal, 2014(2014): 1-8.

[17] ASSEM M S, LUIS S F, RONALD S R, et al. Effect of dietary inclusion of Leucaena leucocephala or Moringa oleifera leaf meal on performance of growing rabbits[J]. Trop Anim Health Prod, 2014, 46(7): 1-6.

[18] 李學(xué)堅(jiān), 鄧家剛, 覃振林, 等. 銀合歡種子總黃酮降血糖作用實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(11): 842-843.

[19] 李學(xué)堅(jiān). 銀合歡葉總黃酮降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志, 2006, 23(4): 277-279.

[20] 李學(xué)堅(jiān), 鄧家剛, 覃振林. 銀合歡葉提取物降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2004, 16(1): 41-42.

[21] 李學(xué)堅(jiān). 銀合歡葉總黃酮抑菌、利尿的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 8(3): 13-14.

[22] 李學(xué)堅(jiān), 鄧家剛, 覃振林. 銀合歡葉總生物堿保肝降酶作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國中醫(yī)藥科技, 2006, 13(3): 164-165.

[23] 馮定遠(yuǎn), ATREJA P P. 銀合歡葉粉中含羞草素在牛瘤胃內(nèi)代謝降解的研究[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào), 1997, 9(3): 23-28.

[24] 馮定遠(yuǎn), ATREJA P P. 銀合歡葉粉中抗?fàn)I養(yǎng)因子DHP在牛瘤胃中降解的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1997(18): 25-29.

[25] 張德權(quán), 臺(tái)建祥, 付勤. 生物類黃酮的研究及應(yīng)用概況[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1999, 25(6): 52-57.

[26] 李加興, 陳選, 鄧佳琴, 等. 黃秋葵黃酮的提取工藝和體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(10): 121-125. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201410022.

[27] 李姝蓓, 張東, 楊嵐, 等. 莢果蕨貫眾提取物中黃酮類成分的含量測(cè)定和抗氧化活性研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2013, 48(21): 1860-1863.

[28] 姜建輝, 趙儉波, 王貴云. 銀合歡葉黃酮的提取工藝[J]. 食品研究與開發(fā), 2014, 35(7): 40-43.

[29] 周鎂, 黃秀平, 桂珊珊, 等. 海拔高度對(duì)黔產(chǎn)寬葉纈草根總黃酮含量的影響[J]. 中藥材, 2014, 37(5): 747-749.

[30] 李利華. 芹菜不同部位總黃酮含量測(cè)定及其抗氧化活性[J]. 食品研究與開發(fā), 2013, 34(7): 12-15.

[31] 韋獻(xiàn)雅, 殷麗琴, 鐘成, 等. DPPH法評(píng)價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(9): 317-322. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201409062.

[32] LI Wu, LIANG Hong, ZHANG Mingwei, et al. Phenolic profi les and antioxidant activity of litchi (Litchi Chinensis Sonn.) fruit pericarp from different commercially available cultivars[J]. Molecules, 2012, 17(12): 14954-14967.

[33] KUMARL P S, SUDHA S. Evaluation of antioxidant activity and total phenolic content of padina boergesenii from Gulf of Mannar[J]. Drug Invention Today, 2012, 4(12): 635-639.

[34] TUNG Y, WU J, HUANG C, et al. Antioxidant activities and phytochemical characteristics of extracts from Acacia confusa bark[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(1): 509-514.

Antioxidant Activities and Total Flavonoid Content in the Peel of Leucaena leucocephala Fruits

YANG Jingyi1, YU Lingling1,2,*, WU Mei1, LIU Jicheng1, ZHANG Yujie1, JIANG Kai1, WANG Bi1
(1. College of Medical Science, China Three Gorges University, Yichang 443002, China；2. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, China Three Gorges University, Yichang 443002, China)

Purpose: To establish a method for the determination of total flavonoids and to evaluate the antioxidant activity of the ethanol extract of Leucaena leucocephala (Lam.) de Wait fruit peel. Methods: The content of total flavonoids was measured by NaNO2-Al(NO3)3assay. The antioxidant property was determined by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging and reducing power assays. Results: The linear range of rutin was 0.01–0.05 mg/mL (r = 0.999 1). The average recovery rate was 99.35% with relative standard deviation (RSD) of 1.37%. The content of total flavonoids was 1.76 mg/g. In DPPH radical scavenging assay, the sample exhibited antioxidant activity in a dose-dependent manner with IC50of 0.32 mg/mL. The IC50for reducing power was 70.12 μg/mL. Conclusions: The developed method is rapid, accu rate, simple, reproducible and suitable for determination of total flavonoids in the fruit peel of L. leucocephala. Moreover, the fruit peel of L. leucocephala is rich in flavonoids and possesses high antioxidant activity.

Leucaena leucocephala (Lam.) de Wait peel； flavonoids； antioxidant activity

R284.1

A

1002-6630（2015）08-0187-04

10.7506/spkx1002-6630-201508034

2014-09-22

湖北省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目（Q20131309）；三峽大學(xué)人才啟動(dòng)基金項(xiàng)目（KJ2011B050）

楊靜毅（1991—），女，本科生，主要從事天然產(chǎn)物質(zhì)量控制研究。E-mail：429883444@qq.com

*通信作者：喻玲玲（1983—），女，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與利用。E-mail：yulingling@ctgu.edu.cn