楊 陽，李榮卓，毛祿剛，劉 霞*

不同粒徑納米金標(biāo)記二抗增強(qiáng)表面等離子共振檢測(cè)E. coli O157∶H7

楊 陽，李榮卓，毛祿剛，劉 霞*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

基于雙通道表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器，結(jié)合不同粒徑的金納米粒子（Au nanoparticle，AuNPs）標(biāo)記多克隆抗體（polyclonal antibody，PAb）作為第二抗體，采用氨基偶聯(lián)的方法將PAb固定在傳感器表面作為第一抗體，采用三明治夾心法進(jìn)行了檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）的研究?？疾? 種粒徑的AuNPs作為標(biāo)記物，增強(qiáng)SPR響應(yīng)信號(hào)檢測(cè)E. coli O157∶H7的能力。結(jié)果表明，增強(qiáng)效果最佳的AuNPs粒徑為17.79 nm，其可檢測(cè)到的E. coli O157∶H7的最低濃度為10 CFU/mL。

金納米粒子；E. coli O157∶H7；表面等離子共振傳感器；標(biāo)記；不同粒徑

隨著食品產(chǎn)業(yè)飛速的發(fā)展，食品安全問題越來越得到消費(fèi)者的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在各種食物中毒事件中，以細(xì)菌引起的食物中毒最多。其中大腸桿菌O15 7∶H7（E. coli O157∶H7）是最常見的細(xì)菌致病菌[1-2]。目前，檢測(cè)E. coli O157∶H7常用的方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly merase chain reaction，PCR）[3]、酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）法[4]、生物傳感器法[5]等。其中，免疫生物傳感器由于其特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于E. coli O157∶H7的檢測(cè)。特別是表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器[6]具有無需標(biāo)記，能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)態(tài)過程，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域[7-9]。國內(nèi)外已有關(guān)于SPR生物傳感器檢測(cè)E. coli O157∶H7的報(bào)道，Si Chengyan等[10]將抗體固定在傳感器表面，基于SPR直接法檢測(cè)E. coli O157∶H7，檢測(cè)限為105CFU/mL。應(yīng)用納米材料可大幅度提高SPR傳感器的檢測(cè)靈敏度[11]，尤其是金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs），由于具有微弱的帶電配體的結(jié)合層，具有特殊的穩(wěn)定性，可以與生物分子發(fā)生非共價(jià)鍵的靜電吸附[12]，且生物分子活性基本不發(fā)生改變，標(biāo)記用量少等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)。AuNPs標(biāo)記抗原或抗體的三明治法檢測(cè)E. coli O157∶H7已有報(bào)道，劉霞等[13]應(yīng)用AuNPs標(biāo)記抗體的方法檢測(cè)了補(bǔ)體C4，與直接法檢測(cè)相比，靈敏度提高了20 倍。Eum等[14]基于AuNPs的增強(qiáng)響應(yīng)信號(hào)作用，應(yīng)用三明治夾心法，將AuNPs-抗體作為二抗，原抗體為一抗檢測(cè)E. coli O157∶H7，結(jié)果表明在標(biāo)記AuNPs的前提下響應(yīng)信號(hào)比沒有標(biāo)記的高3.8 倍。

本實(shí)驗(yàn)分別將不同粒徑的AuNPs標(biāo)記E. coli O157∶H7 PAb作為第二抗體，以固定在SPR傳感器芯片表面的PAb作為第一抗體，應(yīng)用三明治夾心法[15]對(duì)E. coli O157∶H7進(jìn)行檢測(cè)，比較了3 種不同粒徑的AuNPs增強(qiáng)SPR響應(yīng)信號(hào)的能力，篩選出最佳尺寸的AuNPs，并應(yīng)用篩選出的AuNPs進(jìn)行實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。此方法簡(jiǎn)單快速，為SPR傳感器在實(shí)際樣品中的檢驗(yàn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無水乙醇、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）、檸檬酸三鈉、四氯金酸（HAuCl4·H2O）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-巰基丙酸（3-mercapto propionic acid，MPA）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺（1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）美國Sigma-Aldrichg公司；E. coli O157∶H7由湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院提供（出血性大腸埃希氏菌二代菌株，編號(hào)為CICC21530，中國工業(yè)菌種保藏中心）；羊抗O157∶H7 PAb 美國International Lab公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

HJ-1型恒溫磁力攪拌器 江蘇醫(yī)療儀器廠；雙通道2000 SPR傳感器和芯片 美國Biosensing Instrument公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；JSM-6380LV型透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；磷酸鹽緩沖液（150 mmol/L NaCl＋20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 7.4）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿、磷酸鹽緩沖液、去離子水及槍頭均經(jīng)高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 AuNPs合成及表征

采用檸檬酸三鈉還原法制備AuNPs[16]，具體步驟如下：分別取0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%氯金酸溶液于三角瓶中，加入49.5 mL去離子水，在磁力攪拌器200 r/min攪拌并加熱至沸騰，沸騰后分別快速加入新配制的1、1.5、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌10 min。溶液顏色由灰色變成黑色，最后變成透亮的紅色后停止加熱，再攪拌10 min。室溫冷卻后分裝到離心管中并分別采用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）和紫外-可見分光光度計(jì)（ultravioletvisible spectrophotometer，UV-Vis）進(jìn)行表征。

1.2.2 AuNPs-PAb復(fù)合物的制備及表征

應(yīng)用目測(cè)法測(cè)定PAb最適標(biāo)記量，將PAb逐級(jí)稀釋后，各取等體積分別加入到一系列裝有1 mL AuNPs的離心管中，離心5 min后，在上述各管內(nèi)再分別加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，混勻靜置2 h以上觀察結(jié)果。若加入PAb不足以穩(wěn)定AuNPs的離心管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入PAb達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的離心管則AuNPs的紅顏色不變。其中含PAb最低的離心管即含穩(wěn)定1 mL AuNPs的必需蛋白量[17]。根據(jù)用已標(biāo)記的AuNPs的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記PAb的總量（實(shí)際實(shí)驗(yàn)中增加20%的量），然后在電磁攪拌器的攪拌下，將PAb溶液逐滴加入AuNPs溶液中（pH 7.4），1 mg的PAb大約5 min加完；在磁性攪拌器的攪拌下，加入pH 7.4的BSA作為封閉劑，并使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。得到的混合液用2 000 r/min離心20 min，去除沉淀，即除去部分大顆粒的AuNPs。所得上清液用10 000 r/min離心60 min后小心除去上清液，即除去未結(jié)合的PAb。所得沉淀（AuNPs-PAb復(fù)合物）用磷酸鹽稀釋并用TEM進(jìn)行表征。

1.2.3 PAb在傳感器表面的固定

室溫條件下，采用滴加的方法，將濃度為10 mmol/L的MPA乙醇溶液滴加在裸露的芯片表面，室溫孵育過夜，次日芯片用乙醇以及二次水反復(fù)沖洗，再用氮?dú)獯蹈?，使MPA在芯片上形成穩(wěn)定的單分子膜，然后將芯片組裝在SPR傳感器上。通入新配制的EDC/NHS（0.4 mol/L∶0.1 mol/L）活化MPA中的羧基，流速為40 μL/min；再通入的質(zhì)量濃度為111.2 μg/mL的PAb（磷酸鹽緩沖液配制）溶液，流速為5 μL/min，將其固定在傳感器芯片表面，最后通入1% BSA封閉芯片表面的非特異性吸附位點(diǎn)。

1.2.4 SPR檢測(cè)

通入一定濃度的E. coli O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌液，流速為10 μL/min，使其與芯片表面的PAb充分反應(yīng)，然后再分別通入3 種粒徑的AuNPs-PAb復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程原理圖如圖1所示。每次反應(yīng)完畢后以20 μL/min的流速通入10 mmol/L的NaOH溶液，將傳感器表面AuNPs-PAb與E. coli O157∶H7的結(jié)合物沖掉至基線穩(wěn)定后，然后通入其他濃度的E. coli O157∶H7，重復(fù)上述步驟，每個(gè)濃度的E. coli O157∶H7至少重復(fù)檢測(cè)3 次。

圖 1 檢測(cè)過程原理圖Fig.1 Principle schematic of E. coli O157∶H7 detection

1.2.5 實(shí)際樣品的制備及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

購買自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)紅旗市場(chǎng)的涼菜，烘箱烘48 h，用滅菌后的研缽研碎，稱取2.5 g加入22.5 mL無菌水混合均勻，過濾后4 ℃冰箱備用。

稀釋樣液加入E. coli O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)菌液，加標(biāo)后E. coli O157∶H7的最終濃度為106CFU/mL。調(diào)節(jié)流速為10 μL/min，通入實(shí)際樣品加標(biāo)溶液，進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算回收率。每次檢測(cè)后采用10 mmo l/L的NaOH溶液使傳感器表面再生。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs的表征

應(yīng)用檸檬酸鈉還原法成功制備了3 種不同粒徑的AuNPs，圖2A分別為3 種粒徑AuNPs的TEM圖，AuNPs粒子形狀較統(tǒng)一，分散也較均勻，并且隨著還原劑檸檬酸三鈉量的不同，粒子粒徑逐漸增大，粒子數(shù)量減少。通過使用粒徑分布計(jì)算軟件分析了3 種粒子的粒徑，可知此次實(shí)驗(yàn)制備的AuNPs平均粒徑分別為17.79、28.22 nm和34.05 nm（圖2B）。圖3為AuNPs的UV-Vis光譜，3種粒徑的AuNPs在520 nm左右均出現(xiàn)了其紫外特征吸收峰，而且紫外吸收峰隨著顆粒尺寸的增大而出現(xiàn)了紅移，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道相一致。

圖 2 AuNPs TEM圖（A）和粒徑分布圖（B）Fig.2 TEM images (A) and size distribution histograms (B) of AuNPs

圖 3 AuNPs的UV-Vis光譜Fig.3 UV-visible absorption spectra of AuNPs

2.2 AuNPs-PAb的表征

圖 4 AuNPs標(biāo)記前后以及抗體的UV-Vis光譜Fig.4 UV-visible absorption spectra of PAb, AuNPs and AuNPs-PAb

由圖4中曲線c可看出，PAb沒有特征峰，而圖4中曲線b可以明顯看出，3 種粒徑的AuNPs分別在波長(zhǎng)520 nm左右處都出現(xiàn)了特征吸收峰，但PAb被AuNPs標(biāo)記后（圖4中曲線a），AuNPs-PAb復(fù)合物在525 nm左右出現(xiàn)了吸收峰，AuNPs-PAb復(fù)合物的特征吸收峰與AuNPs的特征吸收峰相比，出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象，這是因?yàn)锳uNPs-PAb復(fù)合物形成之后，粒子粒徑變大所致，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道相一致。另外，也可看出AuNPs-PAb復(fù)合物的吸光度明顯下降，PAb被AuNPs成功標(biāo)記。

2.3 SPR檢測(cè)結(jié)果

圖 5 3種粒徑的AuNPs增強(qiáng)三明治夾心法檢測(cè)E. coli O157∶H7的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 SPR dynamics curves of AuNPs of three different sizes enhanced sandwich assay for E. coli O157∶H7 detection

PAb在SPR芯片表面自組裝成穩(wěn)定的抗體分子膜后，分別向流通池中通入不同菌液濃度的E. coli O157∶H7，然后通入AuNPs-PAb復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)的SPR動(dòng)力學(xué)曲線如圖5所示（以菌液濃度為108CFU/mL E. coli O157∶H7為例）。從圖5可明顯看出，通入PAb后立刻引起了SPR的響應(yīng)信號(hào)，1 200 s基本達(dá)到平衡，SPR響應(yīng)信號(hào)的變化（Δθ）值為82 mDeg，說明PAb已經(jīng)被成功的固定在傳感器表面。當(dāng)傳感器表面被PBS沖洗后，注入BSA也引起了SPR響應(yīng)信號(hào)的變化，說明傳感器芯片表面的空位點(diǎn)已被BSA封閉。此時(shí)，注入E. coli O157∶H7引起的SPR響應(yīng)信號(hào)的變化并不是很明顯，當(dāng)E. coli O157∶H7完全與一抗結(jié)合后，再注入AuNPs-PAb的復(fù)合物時(shí)，引起了明顯的SPR響應(yīng)信號(hào)的變化（注入AuNPs-PAb前的基線與注入AuNPs-PAb后響應(yīng)信號(hào)經(jīng)過高峰平臺(tái)期后下降并穩(wěn)定的基線的差值），可明顯看出粒徑為17.79 nm的AuNPs標(biāo)記二抗產(chǎn)生的SPR響應(yīng)信號(hào)改變值最大，其次分別為粒徑34.05 nm和28.22 nm的AuNPs，這主要是由于AuNPs的比表面積增大了PAb的承載量，使復(fù)合物的折射率明顯增大及AuNPs的表面等離子體子（surface plasmons，SP）與金膜本身的SP發(fā)生了耦合的原因。待反應(yīng)完成之后通入10 mmol/L NaOH使傳感器表面再生。

圖 6 3種粒徑檢測(cè)不同濃度E. coli O157∶H7的工作曲線Fig.6 Working curves for detecting different concentrations of E. coli O157∶H7 based on different sizes of AuNPs

如圖6所示，隨著E. coli O157∶H7濃度的增加，SPR響應(yīng)的變化值也隨之增加，17.79 nm AuNPs增加SPR響應(yīng)信號(hào)的變化值最為明顯，其次為34.05 nm，最后為28.22 nm，與圖5所示結(jié)果一致。當(dāng)E. coli O157∶H7的濃度為108CFU/mL，粒徑分別為17.79、28.22 nm和34.05 nm的AuNPs標(biāo)記二抗所引起的SPR響應(yīng)信號(hào)的變化值分別為17.415、7.2373 mDeg和9.9403 mDeg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為8.019%、7.723%和9.306%。這表明，檢測(cè)相同濃度的E. coli O157∶H7，17.79 nm AuNPs增強(qiáng)SPR的效果幾乎是28.22 nm和34.05 nm的AuNPs的2 倍。而且E. coli O157∶H7的濃度越大，17.79 nm AuNPs增強(qiáng)SPR的效果越強(qiáng)，而28.22 nm和34.05 nm的增強(qiáng)效果趨于平緩，當(dāng)E. coli O157∶H7的濃度為1015CFU/mL時(shí)，兩者產(chǎn)生的SPR信號(hào)基本差不多。

圖 7 17.79 nm AuNPs檢測(cè)不同濃度E. coli O157∶H7的線性關(guān)系曲線Fig.7 Linear relationship curve of SPR assay for detection of E. coli O157∶H7 at different concentrations using 17.79 nm AuNPs

一般來說，在一定的粒徑范圍內(nèi)，隨著AuNPs粒徑的增加，SPR響應(yīng)信號(hào)也隨之增強(qiáng)。Zeng Shuwen等[19]系統(tǒng)地研究了AuNPs粒徑對(duì)于SPR響應(yīng)信號(hào)的影響規(guī)律，研究表明當(dāng)AuNPs的粒徑小于40 nm時(shí)，SPR響應(yīng)信號(hào)隨著粒徑的增大而增加；當(dāng)AuNPs粒徑大于40 nm時(shí)，SPR響應(yīng)信號(hào)隨著粒徑的增大反而減小。而本實(shí)驗(yàn)獲得的AuNPs標(biāo)記二抗增強(qiáng)SPR響應(yīng)信號(hào)的最佳粒徑為17.79 nm，其次是34.05 nm，最后為28.22 nm。這或許是以下兩個(gè)原因?qū)е碌木C合效應(yīng)，一是由于粒徑較大的AuNPs被PAb包被后，導(dǎo)致AuNPs-PAb復(fù)合物粒徑更大，當(dāng)AuNPs-PAb復(fù)合物與芯片表面的E. coli O157∶H7結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致空間位阻的效應(yīng)更明顯；二是由于E. coli O157∶H7本身也比較大（0.5～1.5 μm），當(dāng)粒徑較大的AuNPs-PAb復(fù)合物與其結(jié)合后，使得傳感器表面的介質(zhì)膜厚度比較大，導(dǎo)致SPR靈敏度下降[20]。圖7是增強(qiáng)效果最佳粒徑的AuNPs（17.79 nm）檢測(cè)E. coli O157∶H7的線性關(guān)系曲線，其最低可檢測(cè)到的濃度為10 CFU/mL，線性范圍為10～1010CFU/mL，相關(guān)系數(shù)為0.991 4，線性回歸方程為Y=2.037 17X＋1.652 22。

2.4 實(shí)際樣品加標(biāo)回收率

應(yīng)用17.79 nm的AuNPs采用同樣的方法進(jìn)行了實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。為了保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，樣品經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的烘干處理，確認(rèn)其無微生物存活后，進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。實(shí)際樣品中的E. coli O157∶H7加標(biāo)量是106CFU/mL，SPR響應(yīng)信號(hào)的變化值是18.284 mDeg，同濃度的E. coli O157∶H7標(biāo)準(zhǔn)品的SPR響應(yīng)信號(hào)的變化值為16.603 mDeg，其加標(biāo)回收率為110.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%，說明該方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸三鈉還原法合成了3 種不同粒徑（17.79、28.22、34.05 nm）的AuNPs，并將不同粒徑的AuNPs標(biāo)記E. coli O157∶H7的PAb制備的AuNPs-PAb復(fù)合物作為二抗，利用氨基偶聯(lián)的方法將PAb固定在傳感器表明作為一抗，采用三明治夾心法，應(yīng)用雙通道SPR傳感器（一個(gè)通道作為參比通道）對(duì)E. coli O157∶H7進(jìn)行了高靈敏的檢測(cè)，考察3 種粒徑的增強(qiáng)能力，篩選出增強(qiáng)效應(yīng)最佳的粒徑為17.79 nm。此方法可明顯增強(qiáng)SPR的檢測(cè)靈敏度，且操作時(shí)間短、試劑用量少、靈敏度高。

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Detection of E. coli O157:H7 Based on Au Nanoparticles of Different Sizes Labeled Second Antibody Enhanced Surface Plasmon Resonance

YANG Yang, LI Rongzhuo, MAO Lugang, LIU Xia*
(Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Fo od Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) was detected by a sandwich method with Au nanoparticles (AuNPs) of different sizes labeled E. col i O157:H7 polyclonal antibody (PAb) as the second antibody and PAb immobilized on the sensor surface as the first anti body using a dual-channel surface plasmon resonance (SPR) sensor. The abil ities of second antibodies labeled with AuNPs of three different sizes to enhance SPR signal were compared. As a result, the optimal AuNPs size was found to be 17.79 nm and the minimum detectable concentration of E. coli O157:H7 was 10 CFU/mL.

AuNPs； E. coli O157:H7； surface plasmon resonance (SPR)； labeling； different particle sizes

S951.42

A

1002-6630（2015）08-0201-05

10.7506/spkx1002-6630-201508037

2014-07-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201375）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303084）

楊陽（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c控制。E-mail：769968476@qq.com

*通信作者：劉霞（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称贩治觥⑹称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：liuxiaspr@aliyun.com