結(jié)直腸癌糞便miRNA-21的表達(dá)及其臨床意義*

鐘武張磊昌鐘世彪江志遠(yuǎn)陳利生郭云△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸外科廣西南寧530021)

[摘要]目的初步探討糞便miRNA-21在結(jié)直腸癌中表達(dá)的作用及臨床意義。方法收集2014年5月至2014年7月間廣西醫(yī)科大學(xué)結(jié)直腸肛門外科收治病理診斷明確的30例結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本，另采集10例健康志愿者糞便作為對照組。采用免疫磁珠法分離糞便脫落細(xì)胞，RT-qPCR方法檢測糞便miRNA-21的表達(dá)，分析miRNA-21的表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果RT-qPCR結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌患者糞便miRNA-21的表達(dá)水平高于正常人，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；根據(jù)臨床病理因素的不同對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行分組比較，結(jié)果顯示：Ⅲ+Ⅳ期結(jié)直腸癌患者miRNA-21的表達(dá)水平要高于Ⅰ+Ⅱ期結(jié)直腸癌患者，P<0.05；低分化患者高于中高分化者P<0.05；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，P<0.05。結(jié)論結(jié)直腸癌糞便miRNA-21表達(dá)的升高可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，糞便miRNA-21可能成為結(jié)直腸癌潛在的腫瘤標(biāo)記物，為結(jié)直腸癌的早期篩查、診斷提供了新的思路。

[關(guān)鍵詞]結(jié)直腸癌；糞便；miRNA-21；免疫磁珠分選

基金項(xiàng)目：*2014年廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號：YCBZ2014032)，桂教重點(diǎn)項(xiàng)目(編號：ZD2014029)

通訊作者△

[中圖分類號]R735.3[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[收稿日期：2015-02-28]

The expresson of fecal microRNA-21 in colorectal cancer

Zhong Wu,Zhang Leichang,Zhong Shibiao,et al.(Department and Anal Surgery,First AffiliatedHospital of GuangXi Medical University,Nanning 530021)

Abstract[]Objective To investigate the expression of fecal microRNA-21 (miRNA-21) in normal human and patients with colorectal cancer. Methods From May 2014 to July 2014, the fecal of 50 patients with colorectal cancer,who received treatment in the first affiliated hospital of Guangxi Medical Uuniversity, department of colorectal surgery, were collectted in this study. The fecal exfoliated cells were isolated by MACS (magnetic cell sorting). RT-qPCR technique was applied to detected the expression of miRNA-21 and analyzed the correlation of miRNA-21 and clinicopathological factors. Results The RT-qPCR result showed that patients with colorectal cancer expressed high levels of miRNA-21 compared with normal human (P<0.05). The expression level of miRNA-21 in middle-late stage (Ⅲ+Ⅳ) of colorectal cancer tissues was significantly higher than early stage(Ⅰ+Ⅱ) (P<0.05). The expression level of miRNA-21 in poorly differentiated tumor tissues was significantly higher than middle-high differentiation (P<0.05). The expression level of miRNA-21 in colorectal cancer with lymph node metastasis was significantly higher than those without lymph node metastasis (P<0.05). Conclusion Increased expression of miRNA-21may be involved in the development of colorectal cancer, and miRNA-21 may be the potential tumor marker of colorectal cancer. It might provide a new way of thinking for colorectal cancer early screening and diagnosis.

[Key words]Colorectal cancer；Fecal；miRNA-21；Magnetic cell sorting

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，根據(jù)2014年美國癌癥協(xié)會最新數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率都排在所有腫瘤的第3位[1]；近年來，隨著我國生活條件和飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，而早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌及其癌前病變是降低結(jié)直腸癌死亡率的關(guān)鍵[2]。近年研究顯示，微小RNA(miRNA)在多種腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中扮演了重要角色，并可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[3]，提示miRNA 可能在結(jié)直腸癌的早期診斷及治療中具有潛在的臨床價值。本研究通過免疫磁珠技術(shù)從人糞便中分離出脫落細(xì)胞，并用實(shí)時熒光定量(RT-qPCR)技術(shù)檢測miRNA-21在結(jié)直腸癌患者和正常人中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理因素的關(guān)系，初步探討miRNA-21在結(jié)直腸癌中的作用及臨床意義。

1材料與方法

1.1一般資料收集2014年5月至2014年7月間廣西醫(yī)科大學(xué)結(jié)直腸肛門外科收治病理診斷明確的30例結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本，其中男19例，女11例，結(jié)腸癌13例，直腸癌17例，年齡41~68歲之間，平均61.7歲，另采集10例健康志愿者糞便作為對照組。所有患者術(shù)前均未行放化療或免疫治療，標(biāo)本采集后迅速放入液氮中，-80℃保存，備用。

1.2材料免疫磁珠(Dynal公司，型號 M-450)，Trizol 試劑(Invitrogen，美國)、DEPC水(Promega，美國)、mirVana miRAN Isolation Kit(Ambion，美國)，Poly(A)Tailing kit(Ambion，美國)、瓊脂糖(Promega，美國)，Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR Quantitation Kit(蘇州吉瑪基因股份有限公司)，磁性分離器(Dynal公司，型號MPC-1)，ABI-7300 實(shí)時熒光定量儀(ABI公司，美國)，使用軟件Primer-Express 2.0進(jìn)行引物與探針的設(shè)計(jì)；內(nèi)參照RNU6B上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長96 bp；miRNA-221上游引物5'-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3'，下游引物為5'-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長73 bp，上述引物均由上海生工合成。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫磁珠法分離糞便脫落細(xì)胞糞便標(biāo)本按1 mL/g用40 mL Hanks緩沖液(含10% FBS，25 mmol/L的HEPES液)重懸，混勻，200 rpm，離心1 min，吸取上層勻漿，用512 μm孔大小的尼龍濾網(wǎng)過濾，濾液加80 μL免疫磁珠，室溫，孵育30 min，使用Dynal MPC-1磁性分離器將細(xì)胞-磁珠復(fù)合物與溶液分離，收集分離出的脫落細(xì)胞，-80℃保存，備用。

1.3.2加尾及反轉(zhuǎn)錄根據(jù)Poly(A)Tailing Kit試劑盒的說明書對總RNA進(jìn)行polyA加尾反應(yīng)30 min。經(jīng)過氯仿苯氛抽提，乙醇沉淀RNA，抽提純化出加尾后的RNA。根據(jù)Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR QuantitationKit 試劑盒的說明書，對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系是20 μL，首先將1 μL RNA、1 μL RT-primer、1 μL dNTp混合物及DEPC水配成10 μL體系，在65℃孵育5 min，然后將包含2 μL 10x RT緩沖液，4 μL MgCl2，2 μL 0.1 MDTT，1 μL RNase OUT和1 μL SuperScript Ⅲ RT共10 μL的反應(yīng)體系加入，混勻，50℃ 50 min，85℃ 5 min，最后加入1 μL RNaseH 37℃，20 min后，收集反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

1.3.3總RNA純度和完整性檢測使用紫外分光光度儀測定提取RNA的濃度及純度。用RNA完整指數(shù)(RNA 1ntegrity number，RIN)衡量總RNA的質(zhì)量，該值從1~10分別反應(yīng)樣本的質(zhì)量。RIN=7~10表示為質(zhì)量好，RIN=5~7表示為質(zhì)量中，若RIN<5則表示質(zhì)量差。

1.3.4RT-qPCR檢測以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)條件：94℃ 5S，58℃ 20S，72℃ 30S，45個循環(huán)，在Rotor-gene6000熒光定量PCR儀上檢測miRNA-21的表達(dá)水平。以RNU6B作為內(nèi)參標(biāo)定目標(biāo)miRNA的表達(dá)量，計(jì)算方法為2-△△CT相對定量法。每個標(biāo)本設(shè)三個平行管，重復(fù)三次。

2結(jié)果

2.1糞便miRNA-21RT-qPCR結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌患者糞便miRNA-21的表達(dá)水平為3.58±0.30，正常人則為1.00±0.13，兩者間比較，經(jīng)檢驗(yàn)t=25.95，P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2結(jié)直腸癌患者糞便miRNA-21表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系根據(jù)臨床病理因素的不同對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行分組比較，結(jié)果顯示：Ⅲ+Ⅳ期結(jié)直腸癌患者miRNA-21的表達(dá)水平要高于Ⅰ+Ⅱ期結(jié)直腸癌患者，P<0.05；低分化患者高于中高分化者P<0.05；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，P<0.05，見表1。

表1糞便miRNA-21表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系

NmiRNA-21表達(dá)水平tP年齡 <60163.66±0.44 ≥60143.51±0.231.6170.111性別 男193.64±0.28 女113.56±0.390.8370.406部位 結(jié)腸133.59±0.25 直腸173.67±0.371.9470.056TNM分期 Ⅰ+Ⅱ143.45±0.22 Ⅲ+Ⅳ163.97±0.464.3520.000分化程度 高中分化243.51±0.25 低分化63.71±0.402.4410.018遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移 有53.72±0.39 無253.45±0.263.0530.003CEA ≤5ng/mL173.54±0.33 >5ng/mL133.67±0.281.6520.104

3討論

miRNA是新發(fā)現(xiàn)的一類含有21～25個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3′UTR 區(qū)部分互補(bǔ)，抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程[4、5]。目前研究人員在許多腫瘤中己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了比較特異性的miRNA，并嘗試用這些miRNA作為腫瘤的診斷標(biāo)志物[6~10]。馬欽[11]等研究顯示has-miR-182、has-miR-17、has-miR-106a、has-miR-93、has-miR-200c、has-miR-92a、has-let-7a、has-miR-20a等8個miRNA 在腫瘤組織中顯著上調(diào)。張益[12]等運(yùn)用實(shí)時定量PCR技術(shù)對100個早期結(jié)腸癌標(biāo)本和正常黏膜標(biāo)本中的miRNA-21的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌標(biāo)本中miRNA-21的表達(dá)要高于正常黏膜，且rniRNA-21過表達(dá)預(yù)示結(jié)腸癌患者預(yù)后較差和較低的生存率。邱實(shí)[13]等則發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血漿及癌組織中的miRNA-21表達(dá)升高。目前，有關(guān)結(jié)直腸癌的miRNA研究標(biāo)本大多來自結(jié)直腸組織或血漿，腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)，而以糞便miRNA作為腫瘤分子標(biāo)志物的研究較為少見。隨著糞便脫落細(xì)胞分離和收集技術(shù)的發(fā)展，檢測糞便結(jié)直腸脫落細(xì)胞已成為目前非侵襲性結(jié)直腸癌篩檢技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。

miRNA-21是在人類組織中發(fā)現(xiàn)較早、研究比較多的miRNA，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中存在明顯的上調(diào)[6~10]，因此認(rèn)為其在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮類癌基因作用。在本研究中我們利用免疫磁珠技術(shù)成功地從少量糞便中分離出純度較高的目的脫落細(xì)胞，并用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸患者和正常人糞便中的miRNA-21的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者糞便miRNA-21的表達(dá)水平要顯著高于正常人(P<0.05)，提示miRNA-21的表達(dá)可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。我們進(jìn)一步根據(jù)患者臨床病理因素的不同對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行分組比較，結(jié)果顯示Ⅲ+Ⅳ期結(jié)直腸癌患者糞便miRNA-21的表達(dá)水平要高于Ⅰ+Ⅱ期結(jié)直腸癌患者(P<0.05)；低分化患者高于中高分化者(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，提示miRNA-21可能參與了結(jié)直腸癌腫瘤的進(jìn)展，miRNA-21表達(dá)的升高是結(jié)直腸癌的不良事件。包龍龍等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 通過蛋白激酶 B/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑促進(jìn)肝癌腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。此外，Ma[15]等人認(rèn)為miR-21表達(dá)水平的下調(diào)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、減少轉(zhuǎn)移和浸潤的作用，同時有研究表明，miR-21激活轉(zhuǎn)錄因子-4和轉(zhuǎn)化生長因子β受體2，從而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和浸潤[16、17]本次研究與以上結(jié)果相符。

綜上所述，結(jié)直腸癌糞便miRNA-21表達(dá)的升高可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，miRNA-21的表達(dá)水平與腫瘤的臨床病理指標(biāo)相關(guān)，其表達(dá)水平的變化可反應(yīng)結(jié)直腸癌患者病情的進(jìn)展程度。因此，糞便miRNA-21可能成為結(jié)直腸癌潛在的腫瘤標(biāo)記物，為結(jié)直腸癌的早期篩查、診斷提供了新的思路。

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