林 煒，楚秋平，王 茜，高觀禎，周建武，2

(1．福州大學(xué)生物工程研究所，福建福州 350002;2．中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院－浙江工商大學(xué)食品營養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心，浙江杭州 310035)

0 引言

板藍(lán)根別名靛青根、藍(lán)靛根、靛根，為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort．)的干燥根，是我國最常用的傳統(tǒng)中藥材，是清熱解毒類中藥的代表，廣泛用于治療多種疾病，如感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、流行性腮腺炎、扁桃體炎、丹毒、各種肝炎、乙型腦炎等［1－6］．近年來，板藍(lán)根在現(xiàn)代臨床上廣泛應(yīng)用于病毒性流感的預(yù)防與治療．

核黃素合酶作為核黃素合成最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在很多細(xì)菌和酵母中都要依賴該酶形成內(nèi)源核黃素，而動物和人類都缺少該酶，無法自身合成，只能從食物中獲取，因此在人類和動物疾病檢測和疫苗設(shè)計上，核黃素合酶作為一個很重要的靶標(biāo)已經(jīng)發(fā)揮了巨大的作用［7］．目前對核黃素合酶的研究主要集中在細(xì)菌和酵母等生物［8－9］，對植物中核黃素合酶的研究還很少，僅在少數(shù)幾種植物上克隆了編碼核黃素的基因，如菠菜、小麥、大麥、高粱、水稻等［10－13］，但這些基因的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其功能還有待研究．

本研究對板藍(lán)根水提物中的多肽組分進(jìn)行了分離純化，得到了一條相對分子質(zhì)量約為7 ku的多肽組分，并對其基本生化性質(zhì)和細(xì)胞毒性、抗病毒活性進(jìn)行研究．通過數(shù)據(jù)比對，發(fā)現(xiàn)該多肽在結(jié)構(gòu)上和核黃素合酶α亞基具有一定的同源性．

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

板藍(lán)根鮮根(安徽阜陽太和縣阮橋鎮(zhèn)板藍(lán)根GAP生產(chǎn)基地);中空纖維膜(截流相對分子質(zhì)量為6 000 u);離子交換色譜SP－5PW(3．9 mm×300 mm，日本TOSOH公司);疏水色譜POROSHP2(4．6 mm×250 mm，美國POROS公司);低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品(Amersham公司);高速冷凍離心機(jī)(Beckman公司);冷凍干燥機(jī)(ALPHA 1－2LD);DYY－5型恒壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠);所用試劑均為分析純．

1．2 方法

1．2．1 板藍(lán)根鮮根蛋白粗提液的制備

稱取板藍(lán)根鮮根500 g，切片后凍于－80℃冰箱，直至硬脆后取出置于高速粉碎機(jī)充分粉碎，于1500 mL 0．01 mol·L－1、pH 7．2 的磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4－NaH2PO4，含0．1 mol·L－1NaCl)中充分浸潤，于4 ℃下攪拌浸提24 h，17 500 r·min－1、4℃下離心20 min，收集上清液，所得上清液即為板藍(lán)根鮮根蛋白粗提液．

1．2．2 中空纖維膜超濾

板藍(lán)根鮮根粗提液經(jīng)過中空纖維膜超濾濃縮后，用0．02 mol·L－1、pH 4．0檸檬酸緩沖液透析，透析結(jié)束后，于17 500 r·min－1、4℃下離心20 min，所得上清液即為板藍(lán)根鮮根蛋白粗提濃縮液．

1．2．3 陽離子交換色譜

用0．02 mol·L－1、pH 4．0檸檬酸緩沖液預(yù)先平衡SP－5PW強(qiáng)陽離子交換色譜柱，流動上樣30 mL，0 ～0．15 mol·L－1NaCl、0．15 ～1 mol·L－1NaCl階段梯度洗脫，流速1．0 mL·min－1，檢測波長280 nm．

1．2．4 疏水色譜

用 0．02 mol·L－1、pH 6．0 的磷酸鹽緩沖液(含1 mol·L－1(NH4)2SO4)預(yù)先平衡 POROS 20 HP2 疏水色譜柱，上樣5 mL，1 ～0 mol·L－1(NH4)2SO4梯度洗脫，流速2．0 mL·min－1，檢測波長280 nm．

1．2．5 RIP2 相對分子量測定

參考王旭等［14］的方法，濃縮膠濃度為4%，中間膠濃度為10%，分離膠濃度16．5%，以上濃度皆為體積質(zhì)量．

1．2．6 RIP2 等電點測定

參照趙先亮等［15－16］的方法，采用垂直板等點聚焦的方法測定RIP2的等電點．

1．2．7 RIP2 N 端序列測定

多肽RIP2經(jīng)過還原SDS－PAGE和電印跡后由福州大學(xué)生物工程研究所采用基于Edman降解法的測序儀進(jìn)行N端氨基酸序列測定．

Edman降解法由偶聯(lián)試劑PITC與多肽鏈自由N末端基團(tuán)反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰肽(PTC肽)．偶聯(lián)反應(yīng)在45～48℃進(jìn)行約15 min并用過量的試劑使有機(jī)反應(yīng)完全．用無水強(qiáng)酸如三氟乙酸(TFA)，使第一個殘基環(huán)化，從而使該殘基從剩余的肽鏈裂解出來，并成為2－苯胺基－噻唑啉酮衍生物(ATZ氨基酸)［17］．

1．2．8 RIP2 MDCK 細(xì)胞毒性

0．25%的胰酶將MDCK細(xì)胞消化后，用MEM培養(yǎng)基制成濃度為4×105cell·mL－1的細(xì)胞懸液．將制備好的MDCK細(xì)胞懸液接種于96孔板中(每孔200μL)置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液．96孔板用PBS清洗2次，于每孔內(nèi)加入濃度分別為9、4．5、2．25、1．13、0．56、0．28 mg·mL－1的樣品200μL，于37 ℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下孵育48 h，以每孔加細(xì)胞維持液200μL作為正常細(xì)胞對照組．取出孵育48 h的MDCK細(xì)胞，棄上清液，于每孔加入1 mg·mL－1的3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽(MTT)50μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，再每孔加入150μL二甲基亞楓(DMSO)作用10 min，于570 nm波長下測量吸光值．

以下式計算細(xì)胞存活率S:其中:S為細(xì)胞存活率(%);A0為正常細(xì)胞對照組于570 nm測得的吸光度;A為實驗樣品于570 nm測得的吸光度．

1．2．9 RIP2抗流感病毒活性測定

在樣品濃度范圍內(nèi)(0．28～9．00 mg·mL－1)，對RIP2樣品進(jìn)行連續(xù)2倍梯度稀釋．在已形成單層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中加入100TCID50病毒稀釋液，每孔200μL，34℃吸附2 h后棄病毒液，用細(xì)胞PBS清洗2遍，加已稀釋好的RIP2各濃度樣品，每孔200μL，每濃度4孔，于34℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，以每孔加入200μL細(xì)胞維持液作為細(xì)胞陰性對照組．用MTT比色法于570 nm波長下測量吸光值，并計算其抗病毒活率．計算公式如下:

其中:A對照組為正常細(xì)胞陰性對照;A病毒組為陽性對照組．

2 結(jié)果與討論

2．1 活性多肽的分離與純化

板藍(lán)根鮮根蛋白粗提濃縮液經(jīng)陽離子交換階段梯度洗脫時，如圖1所示，洗脫得到四個吸光值較高的組分峰:SP1、SP2、SP3和SP4，分別收集穿透峰及SP1、SP2、SP3、SP4進(jìn)行SDS－PAGE檢測，如圖2所示，穿透峰無蛋白條帶，SP3和SP4各有一條濃度較高的蛋白條帶，而RIP2在峰SP1中，將其與濃縮液電泳條帶相比較，結(jié)果表明，粗提液經(jīng)陽離子交換色譜分離后，目標(biāo)多肽得到初步的分離．

圖1 SP－5PW分離圖譜Fig．1 Chromatogram of SP －5PW

圖2 SP－5PW色譜SDS－PAGE圖Fig．2 SDS－PAGE chromatogram of SP－5PW

峰SP1經(jīng)過POROS HP2疏水色譜柱的分離共洗脫出兩個峰，分別收集穿透峰、峰SP1HPP1和峰SP1HPP2，如圖3所示．經(jīng)SDS－PAGE鑒定，RIP2在峰SP1HPP2中，如圖4所示．對峰SP1HPP2進(jìn)行Tricine－SDS－PAGE鑒定，結(jié)果顯示RIP2已經(jīng)達(dá)到了電泳純，如圖5所示．

2．2 板藍(lán)根蛋白的性質(zhì)表征

2．2．1 RIP2 相對分子質(zhì)量標(biāo)定

RIP2經(jīng)過Tricine－SDS－PAGE后，分別量出Tricine－SDS－PAGE電泳膠上標(biāo)準(zhǔn)蛋白、待測蛋白和染料距分離膠頂端的距離，計算出相對遷移率(即樣品遷移距離/染料遷移距離)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量的對數(shù)對它的相對遷移率作圖，得到蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線．由該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出RIP2的相對分子質(zhì)量為6．87 ku．

圖3 POROSHP2分離圖譜Fig．3 Chromatogram of POROSHP2

圖4 POROSHP2色譜SDS－PAGE圖Fig．4 SDS － PAGE chromatogram of POROSHP2

圖5 RIP2－SDS－PAGE圖Fig．5 SDS － PAGEof RIP2

2．2．2 RIP2 等電點測定

通過計算相對遷移率(即樣品遷移距離/膠條總長)，可以計算出RIP2的等電點為7．73．RIP2等電點偏堿性，說明RIP2的堿性氨基酸含量較高，含有較多的自由氨基．

2．2．3 RIP2 N 端序列測定

對轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上的RIP2進(jìn)行N端氨基酸序列的測定，測定了10個氨基酸殘基，依次為QIGEFATAPF．通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫的檢索，發(fā)現(xiàn)其與核黃素合酶α亞基具有同源性，序列比對結(jié)果如表1．核黃素合酶在植物生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)及抗病性上的作用僅在少數(shù)幾種植物中進(jìn)行了部分研究．如擬南芥的核黃素合酶可通過與生物激發(fā)子HpaGxoo作用從而發(fā)揮一定的抗病防衛(wèi)作用［18］;而水稻核黃素合酶對植物的生長發(fā)育、活性氧的消除、抗病性以及細(xì)胞死亡都有非常重要的作用［12］．有研究表明核黃素分子中較長的D－核糖醇支鏈阻礙了異咯嗪平面環(huán)與DNA的嵌插作用，因而其主要作用方式是溝面作用和靜電作用．通過這些作用核黃素可部分干擾DNA的模板作用，產(chǎn)生一定的抗腫瘤、抗病毒功能［19］．因此可推測該多肽對板藍(lán)根自身生長及其抗病毒性具有一定影響．

表1 RIP2N同源性比對結(jié)果Tab．1 The homology comparision of RIP2N

2．2．4 RIP2抗流感病毒活性研究

板藍(lán)根常用于治療風(fēng)熱感冒等病癥［20］，狗腎上皮細(xì)胞(Madin－Darby Canine Kidney cells，MDCK)是流感病毒的易感細(xì)胞株之一［21］，故MDCK細(xì)胞和流感病毒相互作用模型常用于中藥抗流感病毒研究［22］．本實驗利用MDCK細(xì)胞對板藍(lán)根肽組分RIP2抗病毒作用進(jìn)行研究．

RIP2抗流感病毒活性研究結(jié)果如圖6所示．?dāng)?shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件分析，得F值為73．362，P值為0．000，小于0．01，說明數(shù)據(jù)表現(xiàn)為極顯著．

如圖6(a)所示，在9．00～0．56 mg·mL－1濃度內(nèi)，RIP2對MDCK細(xì)胞表現(xiàn)出較大的毒性作用，其中在9．00 mg·mL－1時，對MDCK細(xì)胞的抑制作用達(dá)到35%;但是隨著RIP2濃度的逐漸降低，其毒性也對應(yīng)降低，直到一定濃度下不再表現(xiàn)出毒性(數(shù)據(jù)沒有顯示)．同時，對應(yīng)濃度的RIP2樣品對MDCK細(xì)胞抗流感病毒的治療實驗從圖6(b)可知:RIP2濃度為4．50 mg·mL－1時，RIP2對MDCK細(xì)胞表現(xiàn)出較高的治療效果，其治療率可以達(dá)到35%，隨著濃度的降低治療效果逐步降低，直到0．56 mg·mL－1時，其治療效果已不顯著．其中RIP2濃度為9．00和0．28 mg·mL－1時，其對MDCK細(xì)胞不具有治療效果，根據(jù)圖6(a)可推測其為該濃度下RIP2本身對MDCK細(xì)胞的毒性作用大于治療作用所致．

圖6 RIP2對MDCK細(xì)胞毒性與治療實驗結(jié)果圖(n=6)Fig．6 The result of RIP2 on MDCK cytotoxicity and therapeutic experiment(n=6)