啟動(dòng)子區(qū)甲基化和組蛋白乙酰化對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞SFRP1 基因表達(dá)的影響

孟 瑩，朱圣韜，李 鵬，張澍田

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化科，國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京市消化疾病中心，消化疾病癌前病變北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050

分泌型卷曲蛋白家族(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)是Wnt 信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)劑，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Frizzled 受體而抑制Wnt 的活動(dòng)，參與多種腫瘤的發(fā)生。近年來(lái)，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因沉默可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［1-3］。本研究目的是觀察SFRP1 基因表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表達(dá)情況，探討DAC 及TSA 對(duì)SFRP1 基因表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步明確SFRP1 基因在ESCC 發(fā)病機(jī)制中的作用，為ESCC 的診治提供新的可能的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1. 1 細(xì)胞:人類ESCC 細(xì)胞株EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所惠贈(zèng)。Heec購(gòu)自Sciencell(美國(guó))，Het-1A 細(xì)胞購(gòu)自ATCC(美國(guó))。1.1.2 主要試劑和藥品:5-氮雜脫氧胞苷(DAC)和曲古抑菌素(TSA)購(gòu)自Sigma 公司;Anti-acetyl-Histone H3 和H4 購(gòu)自Millipore 公司;染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購(gòu)自Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代。Heec、Het-1A 復(fù)蘇后于各自專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)SFRP1 mRNA 表達(dá):按TRIzol 試劑說(shuō)明書提取各細(xì)胞系總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH 作為內(nèi)參照，其引物及退火溫度見表1。

表1 引物序列表Tab 1 Sequences for primers used in this study

1.2.3 DNA 提取及亞硫酸鹽修飾:使用細(xì)胞基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN DP208，中國(guó))，按說(shuō)明書進(jìn)行。亞硫酸鹽修飾采用CpGenome DNA 修飾試劑盒(Chemicon，CA，USA)，按說(shuō)明書進(jìn)行。修飾好的DNA 用于進(jìn)一步的測(cè)序和MSP 分析。

1.2.4 甲基化分析:甲基化特異性PCR 方法(methylation-specific PCR，MSP)分析組織SFRP1 基因甲基化狀態(tài)。引物序列見表1，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR 產(chǎn)物條帶的位置。

1.2.5 DAC 及TSA 處理EC9706 細(xì)胞:EC9706 細(xì)胞株保存于液氮中，臨用前取出復(fù)蘇，含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，按常規(guī)方法置于37℃、5% CO2混合氣體恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞每1 ～2 d 換液一次。每2 ～3 d 以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶4傳代，接種在新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

單獨(dú)給藥時(shí)，將EC9706 細(xì)胞株分別與去甲基化制劑DAC 10 μmol/L 及組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 共同孵育24 h 和72 h。DAC、TSA 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，則將DAC 10 μmol/L 與EC9706 細(xì)胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L與EC9706 細(xì)胞株共同孵育24 h。各濃度藥物處理細(xì)胞后，每24 h 更換含藥物的培養(yǎng)液一次。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)變化，并且提取細(xì)胞總RNA 及用RT-PCR 方法檢測(cè)SFRP1 mRNA 表達(dá)恢復(fù)情況。

1.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測(cè)EC9706 細(xì)胞組蛋白乙?；闆r:采用ChIP 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按說(shuō)明書進(jìn)行。計(jì)數(shù)大約3 ×106EC9706 細(xì)胞，甲醛交聯(lián)組蛋白和DNA，超聲破碎細(xì)胞和剪切DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定超聲破碎效果。加入乙酰化組蛋白H3 抗體或乙?；M蛋白H4 抗體沉淀，收集抗體綁定的組蛋白-DNA 復(fù)合物，逆轉(zhuǎn)組蛋白-DNA 交聯(lián)，用蛋白酶K 處理和純化DNA，設(shè)計(jì)SFRP1 啟動(dòng)子區(qū)域的引物，引物序列見表1，PCR 方法鑒定已純化的DNA，并用2%瓊脂糖凝膠電泳，回收瓊脂糖凝膠PCR 產(chǎn)物，連接T 載體，進(jìn)行產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選，鑒定陽(yáng)性重組子和測(cè)序確認(rèn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料用s 描述，兩組間變量比較采用t 檢驗(yàn)。率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 細(xì)胞系及永生化食管上皮細(xì)胞系中SFRP1 mRNA 的表達(dá) EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13細(xì)胞株中均未見SFRP1 mRNA 表達(dá)，而Het-1A、Heec中可見其表達(dá)(見圖1)。

2.2 ESCC 細(xì)胞株及永生化食管上皮細(xì)胞株中SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài) MSP 方法檢測(cè)ESCC細(xì)胞株及永生化食管上皮細(xì)胞株中SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)(見圖2)。EC109、EC9706、KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13均只見M 條帶、U 條帶未見;Het-1A、Heec U 條帶亮，M 條帶隱約可見;KYSE70 均可見U 和M 條帶。

圖1 ESCC 各細(xì)胞系及永生化食管上皮細(xì)胞系中SFRP1 基因的RT-PCR 電泳圖Fig 1 Expression of the SFRP1 gene in ESCC cell lines，with GAPDH as a control

圖2 MSP 方法示ESCC 各細(xì)胞株及永生化食管上皮細(xì)胞株中SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)凝膠電泳圖 U:非甲基化條帶;M:甲基化條帶Fig 2 Promoter hypermethylation of SFRP1 gene was shown in ESCC cell lines and two immortalized human esophageal epithelial cell lines (Het-1A and Heec) U:unmethylated;M:methylated

2.3 DAC 和TSA 干預(yù)對(duì)ESCC 細(xì)胞的影響 根據(jù)各株細(xì)胞SFRP1 表達(dá)水平及啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平差異，選擇高甲基化同時(shí)SFRP1 mRNA 無(wú)表達(dá)的EC9706 細(xì)胞株作為進(jìn)一步研究對(duì)象。去甲基化制劑DAC 10 μmol/L 或組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 分別單獨(dú)與EC9706 細(xì)胞株共同孵育72 h 和24 h 后，用RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞株中SFRP1 mRNA 表達(dá)恢復(fù)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC9706 細(xì)胞株SFRP1 mRNA 無(wú)明顯變化(見圖3A)。DAC 10 μmol/L 和TSA 聯(lián)合應(yīng)用，即DAC 10 μmol/L 與EC9706 細(xì)胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 與EC9706 細(xì)胞株共同孵育24 h，再次檢測(cè)細(xì)胞株中SFRP1 mRNA 表達(dá)恢復(fù)情況，結(jié)果可見EC9706 細(xì)胞株SFRP1 mRNA 恢復(fù)表達(dá)(見圖3B)。

2.4 EC9706 細(xì)胞株中SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?；癄顟B(tài) 采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析EC9706 細(xì)胞株中SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白乙酰化狀態(tài)。分別用乙?；M蛋白H3 抗體、乙?；M蛋白H4 抗體沉淀DNA 作為模板進(jìn)行PCR，兔IgG 作為陰性對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)均帶有內(nèi)對(duì)照(Input)。PCR 鑒定結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4 所示。PCR 產(chǎn)物回收后進(jìn)行連接測(cè)序，結(jié)果符合SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)序列。

圖3 DAC 和TSA 干預(yù)對(duì)EC9706 細(xì)胞株中SFRP1 mRNA表達(dá)影響的RT-PCR A:DAC 和TSA 單獨(dú)干預(yù)EC9706 細(xì)胞株中后，未見EC9706 細(xì)胞株SFRP1 mRNA 表達(dá)恢復(fù);GAPDH:內(nèi)參照;B:DAC 10 μmol/L 與TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 聯(lián)合干預(yù)后，可見EC9706 細(xì)胞株SFRP1 mRNA 表達(dá)恢復(fù)Fig 3 Re-expression of SFRP1 mRNA in EC9706 after treatment with DAC and/or TSA by RT-PCR A:EC9706 cells were treated with DAC and TSA alone，with GAPDH as a control;B:EC9706 cells were treated with DAC and TSA together

圖4 EC9706 細(xì)胞株中SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3、H4 乙?；癄顟B(tài)ChIP 結(jié)果 H3Ac、H4Ac:實(shí)驗(yàn)對(duì)象;NAC:陰性對(duì)照;IN:內(nèi)對(duì)照Fig 4 Histone modification analysis at CpG islands of the SFRP1 promoter region by ChIP assay H3Ac，H4Ac:experimental object;NAC:negative control;IN:internal control

3 討論

SFRP1 基因位于染色體8p12-11.1，該位點(diǎn)在多種腫瘤中缺失，被認(rèn)為可能是一個(gè)抑癌基因［4-5］。抑癌基因表達(dá)沉默是腫瘤發(fā)生過(guò)程中一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制，而DNA 甲基化是抑癌基因表達(dá)沉默的重要途徑。Suzuki 等［2-3］研究認(rèn)為啟動(dòng)子區(qū)高甲基化所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默是結(jié)直腸癌SFRP1 水平降低的主要機(jī)制;乳腺癌中也可見類似的研究結(jié)果。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)SFRP1 基因作為一個(gè)可能的抑癌基因，在ESCC 細(xì)胞株中完全不表達(dá)，而在永生化食管上皮細(xì)胞中可以檢測(cè)到該基因的明顯表達(dá)，表明該基因存在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)改變，提示SFRP1 基因可能作為一個(gè)抑癌基因，在ESCC 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用。同時(shí)，MSP 研究發(fā)現(xiàn)，ESCC 腫瘤細(xì)胞系中存在SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，而在永生化人類食管上皮細(xì)胞系中甲基化程度極低。提示啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能與ESCC 中SFRP1 基因的表達(dá)異常相關(guān)。Ishii等［6］研究發(fā)現(xiàn)SFRP1 在ESCC、上皮內(nèi)瘤變及正常組織中均存在啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，甲基化程度呈逐漸降低趨勢(shì)，這和我們的研究結(jié)果相一致。

研究表明DNA 高甲基化可被許多因素調(diào)控，去甲基化制劑是最常見的一種干預(yù)手段，可使部分表達(dá)沉默的抑癌基因表達(dá)恢復(fù)。5 氮雜脫氧胞苷是有效的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能時(shí)間和劑量依賴性地引起CpG 島過(guò)甲基化的抑癌基因去甲基化，從而恢復(fù)其mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，在基因表達(dá)調(diào)控、DNA 修復(fù)、基因穩(wěn)定等方面起重要作用［7］。TSA 是一種常用的組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑，能夠抑制HDAC 活性，使組蛋白高度乙?；源藖?lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)CpG 島甲基化和組蛋白修飾既可獨(dú)立存在，也能相互影響［8］。有研究認(rèn)為，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)恢復(fù)抑癌基因表達(dá)的作用可高于單獨(dú)應(yīng)用某一種［9-10］。

我們選擇SFRP1 基因mRNA 不表達(dá)且同時(shí)存在基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的EC9706 細(xì)胞株作為進(jìn)一步研究對(duì)象，單獨(dú)給予DAC 及TSA 處理，均未能恢復(fù)SFRP1 基因的表達(dá);但聯(lián)合DAC 和TSA 共同處理該細(xì)胞株后，SFRP1 基因表達(dá)卻得到了恢復(fù)，表明基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化和組蛋白乙?；揎椏赡芄餐瑓⑴c了SFRP1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。國(guó)內(nèi)外其他研究也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用DAC 及TSA 可有效恢復(fù)Wnt 相關(guān)基因mRNA 再表達(dá)［11-12］。

為進(jìn)一步說(shuō)明組蛋白乙?；虳NA 甲基化共同參與了SFRP1 在EC9706 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控過(guò)程，我們還用ChIP 方法以乙?；M蛋白H3、H4 抗體免疫沉淀染色質(zhì)片段，然后PCR 擴(kuò)增SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)，擴(kuò)增出SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)片段后進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)為SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)序列，從而表明SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合有乙?；M蛋白H3 及H4，進(jìn)一步說(shuō)明組蛋白乙酰化和DNA 甲基化共同參與了SFRP1 在EC9706 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，ESCC 中存在SFRP1基因的表達(dá)下調(diào)和SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化及組蛋白乙酰化，去甲基化制劑DAC 和HDAC 抑制劑共同作用可恢復(fù)SFRP1 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。從實(shí)驗(yàn)中我們可以進(jìn)一步推測(cè)，SFRP1 基因作為一個(gè)可能的抑癌基因，其異常表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能通過(guò)Wnt 通路參與了ESCC 的發(fā)病過(guò)程，未來(lái)可能為ESCC 患者的診治提供新的方向，但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)及臨床研究來(lái)證實(shí)。

［1］ Valcz G，Patai AV，Kalmár A，et al. Myofibroblast-derived SFRP1 as potential inhibitor of colorectal carcinoma field effect［J］. PLoS One，2014，9 (11):e106143.

［2］ Suzuki H，Gabrielson E，Chen W，et al. A genomic screen for genes upregulated by demethylation and histone deacetylase inhibition in human colorectal cancer［J］. Nat Genet，2002，31(2):141-149.

［3］ Wang S，Dorsey TH，Terunuma A，et al. Relationship between tumor DNA methylation status and patient characteristics in African-American and European-American women with breast cancer［J］. PLoS One，2012，7(5):e37928.

［4］ Armes JE，Hammet F，de Silva M，et al. Candidate tumor-suppressor genes on chromosome arm 8p in early-onset and high-grade breast cancers［J］. Oncogene，2004，23(33):5697-5702.

［5］ Awakura Y，Nakamura E，Ito N，et al. Methylation-associated silencing of SFRP1 in renal cell carcinoma［J］. Oncol Rep，2008，20(5):1257-1263.

［6］ Ishii T，Murakami J，Notohara K，et al. Oesophageal squamous cell carcinoma may develop within a background of accumulating DNA methylation in normal and dysplastic mucosa［J］. Gut，2007，56(1):13-19.

［7］ Fulda S，Kufer MU，Meyer E，et al. Sensitization for death receptoror drug-induced apoptosis by re-expression of caspase-8 through demethylation or gene transfer ［J］. Oncogene，2001，20 (41):5865-5877.

［8］ Sarkar S，Horn G，Moulton K，et al. Cancer development，progression，and therapy:an epigenetic overview［J］. Int J Mol Sci，2013，14(10):21087-21113.

［9］ Steele N，F(xiàn)inn P，Brown R，et al. Combined inhibition of DNA methylation and histone acetylation enhances gene re-expression and drug sensitivity in vivo［J］. Br J Cancer，2009，100(5):758-763.

［10］ Cameron EE，Bachman KE，Myohanen S，et al. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer［J］. Nat Genet，1999，21(1):103-107.

［11］ Gotze S，Wolter M，Reifenberger G，et al. Frequent promoter hypermethylation of Wnt pathway inhibitor genes in malignant astrocytic gliomas［J］. Int J Cancer，2010，126(11):2584-2593.

［12］ Qi J，Zhu YQ，Luo J，et al. The role of secreted Wnt-antagonist genes hypermethylation in early detection of colorectal tumor ［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2007，87(28):1954-1957.