Oct4和Sox2在食管鱗癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性探討

杜華陽(yáng)1，李秀娟2，范婕2，李玉珍2

(1.河北北方學(xué)院影像學(xué)本科2012級(jí)1班，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

摘要：目的探討Oct4和Sox2在食管鱗癌組織中的表達(dá)及二者之間的相關(guān)性。方法應(yīng)用免疫組化SP法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)98例食管鱗癌標(biāo)本及43例正常食管黏膜組織中Oct4和Sox2的表達(dá)情況，分析其與各臨床病理特征的關(guān)系及二者之間的相關(guān)性。結(jié)果食管鱗癌組織Oct4和Sox2的陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常組織(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，癌組織中Oct4和Sox2的蛋白相對(duì)含量也明顯高于正常組織(P<0.05)。隨著分化程度的降低，Oct4和Sox2的表達(dá)明顯升高，即二者與食管癌組織的分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，且Oct4和Sox2的表達(dá)與TNM分期、有無(wú)外膜浸潤(rùn)明顯相關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別無(wú)關(guān)。食管鱗癌組織中Oct4和Sox2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.295，P=0.003)。結(jié)論Oct4和Sox2在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，有望成為食管癌生物治療的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：Oct4；Sox2；食管鱗狀細(xì)胞癌

中圖分類(lèi)號(hào)：R 735.1

作者簡(jiǎn)介：何澤生(1980-)，男，福建廈門(mén)人，醫(yī)學(xué)碩士，住院醫(yī)師。

通訊作者：安國(guó)芝(1959-)，女，河北張家口人，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師。

Expressions of Oct4 and Sox2 Protein and Their Correlations

in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

DU Hua-yang1,LI Xiu-juan2,FAN Jie2，et al

(1.Grade 2012，Department of Imaging Medicine,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei China；2.Department of Pathology,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression of Oct4 and Sox2 proteins and their correlations in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).MethodsImmunohistochemistry staining SP and folw cytometry(FCM)were used to detect the expression of Oct4 and Sox2 in 98 cases of ESCC and 43 normal mucous memebranes.Subsequently the relationship between postoperative pathological features was analyzed with the expression of Oct4 and Sox2.ResultsThe expressions of Oct4 and Sox2 in ESCC were obviously higher than that in normal esophageal(P<0.05).For the protein relative level detected by FCM,there was a significant deference between the ESCC and normal esophageal of the protein content of Oct4 and Sox2(P<0.05).With the loss of differentiation degree,the expressions of Oct4 and Sox2 obviously rose in ESCC.The correlation is negative between Oct4 and Sox2 with the differentiation degree(P<0.05).The expressions of Oct4 and Sox2 were positively correlated to TNM stage and invasion of adventitia(P<0.05).Oct4 expression in ESCC was positively correlated with that of Sox2(r=0.295，P=0.003).ConclusionOct4 and Sox2 play crucial roles in occurrence and progression and are useful for the target therapy of ESCC.

Key words:Oct4;Sox2;esophageal squamous cell carcinoma

Oct4(octamer-binding transcription factor 4)和Sox2(SRY-related high-mobility-group box gene 2)是胚胎早期發(fā)育和維持胚胎干細(xì)胞特征必須的轉(zhuǎn)錄因子，二者在消化道器官發(fā)育和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Oct4主要表達(dá)于早期生殖細(xì)胞，隨著生殖細(xì)胞的成熟其表達(dá)逐漸下調(diào)。Nichols等敲除小鼠的Oct4基因后，由于胚胎發(fā)育早期不能形成多能性的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，最終導(dǎo)致小鼠胚胎死亡。Sox2屬于Sox家族，作為干細(xì)胞的另一個(gè)標(biāo)志物，其主要功能是參與胚胎發(fā)育，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞的活性。

本研究采用免疫組織化學(xué)SP法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Oct4和Sox2蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及相互關(guān)系，以期為深入研究食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及尋找腫瘤新型靶向治療方法提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1　標(biāo)本

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2012-01-01—2013-06-30切除存檔的食管癌標(biāo)本蠟塊98例，患者年齡36~82歲，平均年齡(61.25±8.13)歲，中位年齡57歲；男65例，女33例。全部病例術(shù)前未經(jīng)任何治療，術(shù)后病理切片確診均為食管鱗狀細(xì)胞癌，其中高分化鱗癌35例，中分化鱗癌21例，低分化鱗癌42例；根據(jù)2003年UICC食管癌TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，I~II期52例，III~IV期46例；無(wú)外膜浸潤(rùn)60例，外膜浸潤(rùn)者38例。從中選取食管癌組織邊緣處(距離腫瘤組織>5 cm)的正常黏膜組織石蠟標(biāo)本43例為對(duì)照。將選出蠟塊行4 μm厚連續(xù)切片2張用于免疫組織化學(xué)染色，另取3張10 μm厚切片進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2　免疫組織化學(xué)染色

鼠抗人Oct4單克隆抗體、鼠抗人Sox2單克隆抗體、免疫組化二抗工作液和DAB顯色試劑盒。染色過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，同時(shí)PBS代替一抗作染色的陰性對(duì)照，用已知Oct4、Sox2染色陽(yáng)性的大腸癌組織切片做二者的陽(yáng)性對(duì)照。

1.3　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

鼠抗人Oct4單克隆抗體、鼠抗人Sox2單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物制品有限公司，兔抗鼠FITC-IgG為Jackson Immuno Research公司產(chǎn)品。石蠟切片二甲苯去蠟，眼科剪將組織剪碎后，用眼科鑷子輕搓組織，同時(shí)用生理鹽水沖洗，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)濾除細(xì)胞團(tuán)塊。收集細(xì)胞懸液，以1 000 r·min-1離心沉淀3 min，棄上清加入1 mL PBS將細(xì)胞懸浮，計(jì)數(shù)后細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)·mL-1，此液即為單細(xì)胞懸液。取單細(xì)胞懸液0.1 mL，分別加鼠抗人Oct4和鼠抗人Sox2單克隆抗體，37℃水浴30 min后分別加兔抗鼠FITC-IgG工作液0.1 mL，避光室溫孵育30 min，經(jīng)500目銅網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.4　結(jié)果判定

Oct4和Sox2主要定位于細(xì)胞核，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(200倍)按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合判定。染色強(qiáng)度：無(wú)色計(jì)為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：<5%為0分，5%~10%為1分，10%~50%為2分，>50%為3分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相乘之積，0分為陰性(-)，1、2分為弱陽(yáng)性(+)，3、4分為中度陽(yáng)性(++)，6、9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；-~+計(jì)為陰性，++~+++計(jì)為陽(yáng)性。

Oct4和Sox2蛋白表達(dá)的相對(duì)含量用熒光指數(shù)(FI)表示，F(xiàn)I=(實(shí)驗(yàn)樣品的平均熒光強(qiáng)度-對(duì)照樣品的平均熒光強(qiáng)度)/正常組織樣品的平均熒光強(qiáng)度。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　食管鱗癌及正常食管組織中Oct4和Sox2的表達(dá)

食管鱗癌組織和正常組織中Oct4表達(dá)的陽(yáng)性率分別為62.2%(61/98)和32.6%(14/43)，χ2=10.579，P=0.001；Sox2在食管鱗癌組織和正常組織中的陽(yáng)性率為59.2%(58/98)和37.2%(16/43)，χ2=5.787，P=0.016，Oct4和Sox2在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(封三圖1~4)。

表1　 食管鱗癌與正常食管組織中Oct4和Sox2的蛋白含量

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)二者蛋白相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示食管鱗癌組織中Oct4的蛋白含量(1.49±0.26)明顯高于正常食管組織(0.96±0.16)(P=0.003)；Sox2的含量(1.52±0.34)也明顯高于正常食管黏膜組織(0.84±0.22)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)(表1)。

2.2　食管鱗癌中Oct4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

食管鱗癌組織中，Oct4在高、中、低分化組的表達(dá)率分別為40.0%(14/35)、61.9%(13/21)和81.0%(34/42)，χ2=13.625，P=0.001，結(jié)果表明隨著分化程度的降低，Oct4的表達(dá)率升高，即Oct4的表達(dá)與分化程度呈負(fù)相關(guān)；I~II期食管癌組織中Oct4的陽(yáng)性率為51.9%(27/52)，III~IV期為73.9%(34/46)，χ2=5.022，P=0.025，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；無(wú)外膜浸潤(rùn)組Oct4的陽(yáng)性率為51.7%(31/60)，外膜浸潤(rùn)組為78.9%(30/38)，χ2=7.368，P=0.007，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Oct4的表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)(表2)。

2.3　食管鱗癌中Sox2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Sox2蛋白在高、中、低分化組的表達(dá)率為45.7%(16/35)、52.4%(11/21)和73.8%(31/42)，χ2=6.750，P=0.034，即Sox2的表達(dá)與分化程度明顯相關(guān)；Sox2在I~II期和III~IV期食管癌組織中的表達(dá)率為48.1%(25/52)和71.7%(33/46)，χ2=5.657，P=0.017；在無(wú)外膜浸潤(rùn)組和外膜浸潤(rùn)組的表達(dá)率為48.3%(29/60)和76.3%(29/38)，χ2=7.541，P=0.006，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sox2的表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2　食管鱗癌Oct4和Sox2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4　食管鱗癌中Oct4和Sox2表達(dá)的相關(guān)性

61例Oct4陽(yáng)性表達(dá)的食管癌組織中Sox2陽(yáng)性表達(dá)者43例，58例Sox2陽(yáng)性表達(dá)的食管癌組織中Oct4陽(yáng)性表達(dá)者43例，Spearman秩相關(guān)分析顯示：Oct4和Sox2在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.295，P=0.003)。

3討論

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率有增高趨勢(shì)。食管癌的早期癥狀不甚明顯，多數(shù)患者在確診時(shí)已達(dá)癌癥的中晚期，是食管癌患者死亡率較高的主要原因之一。因此，探討食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，了解腫瘤的生物學(xué)行為，尋找腫瘤新的治療切入點(diǎn)具有重要的臨床意義。

Oct4是調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞多聚潛能性的一種重要調(diào)節(jié)因子，其在參與胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的自我更新、維持細(xì)胞全能性等方面具有重要作用。近來(lái)隨著人們對(duì)腫瘤干細(xì)胞的深入研究發(fā)現(xiàn)，Oct4在生殖細(xì)胞腫瘤如睪丸生殖細(xì)胞瘤、卵巢無(wú)性細(xì)胞瘤和非生殖細(xì)胞腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌及肺癌[10]等高表達(dá)，但在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，這些結(jié)果均證實(shí)Oct4與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

Sox2是Sox家族成員，其基因定位于人類(lèi)染色體3q26.3~q27。在脊椎動(dòng)物早期發(fā)育中，Sox2是最早表達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)特異性基因之一，能夠參與胚胎發(fā)育，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞活性。有研究[11]指出Sox2能與Oct4組成Oct4-Sox2復(fù)合物，維持和協(xié)同Oct4表達(dá)。因此，作為干細(xì)胞的另一個(gè)標(biāo)志物，Sox2在多種惡性腫瘤中如前列腺癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[13]、大腸癌[14]中也有高表達(dá)。

本研究免疫組化結(jié)果顯示Oct4、Sox2在食管鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于正常食管黏膜組織，與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。且Oct4和Sox2的表達(dá)與組織分化程度、TNM分期、外膜浸潤(rùn)明顯相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)。Oct4和Sox2的相關(guān)分析顯示二者呈正相關(guān)，提示在食管癌組織中Oct4與Sox2的表達(dá)呈協(xié)同關(guān)系，二者在食管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，對(duì)Oct4和Sox2進(jìn)行深入研究可能找到食管癌生物治療新靶點(diǎn)。

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[責(zé)任編輯：李薊龍英文編輯：謝利峰]