喬木 程碧軍 武華玉 黃京書 劉貴生 彭先文 李良華 吳俊靜 梅書棋

摘要：為了尋找鑒定與豬骨骼肌生長發(fā)育相關的基因，克隆了豬TCAP基因1 662 bp的核心啟動子序列，通過軟件預測，構(gòu)建了7個缺失片段表達載體，轉(zhuǎn)染PK細胞，確定了其核心啟動子序列位于轉(zhuǎn)錄翻譯起點上游0～155 bp之間。

關鍵詞：豬;TCAP基因;啟動子;轉(zhuǎn)錄活性

中圖分類號：Q78 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-6051-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.065

Cloning and Activity Analysis of Pig TCAP Gene Promoter

QIAO Mu1a，CHENG Bi-jun1b，WU Hua-yu1a，HUANG Jing-shu2，LIU Gui-sheng1a，PENG Xian-wen1a，Li Liang-hua1a， WU Jun-jing1a，MEI Shu-qi1a

（1a. Institute of Animal and Veterinary Science;1b. Technical Institute of Agricultural Economy， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Hubei Provence， Wuhan 430070， China）

Abstract：It has great implications for identifying pig genes which have function in skeletal muscle growth and development. The promoter sequences （1 662 bp） of pig TCAP gene was cloned， 7 plasmid vectors with deletion of different fragments to transfect PK cell was constructed， and found the core promoter sequence of TCAP gene was located in 0～155 bp upstream.

Key words：pig; TCAP gene;promoter;transcriptional activity

TCAP蛋白（Titin-cap，Telethonin）是一種在橫紋肌和心肌中特異性表達的蛋白，是肌聯(lián)蛋白激酶的作用底物，綁定于肌聯(lián)蛋白Z1-Z2區(qū)[1]，通過連接和支撐肌聯(lián)蛋白為其他肌纖維蛋白提供結(jié)合位點，從而在調(diào)節(jié)肌原纖維的組裝中起到重要作用[2]。該蛋白除在肌原纖維的組裝中扮演重要角色外，對肌原纖維的翻轉(zhuǎn)同樣起著重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)該基因與肌肉萎縮、心肌癥、肌肉營養(yǎng)不良、心肌損傷等相關[4-6]。

TCAP基因定位于人染色體HSA17q1.2，由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，編碼167個氨基酸[7]。Cheong等[8]克隆了牛的TCAP基因，編碼了166個氨基酸，其與人和鼠的TCAP基因相似性達到95.8%和95.2%;牛TCAP基因第一內(nèi)含子和第二外顯子的多態(tài)位點與肌肉大理石紋評分顯著相關。黃京書[9]分離克隆了豬TCAP基因部分序列，本試驗采用PCR方法克隆豬TCAP基因的啟動子序列，并研究TCAP基因啟動子不同區(qū)段的轉(zhuǎn)錄活性，為研究TCAP基因表達調(diào)控機制奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

大白豬（湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場）、梅山豬（英山縣綠源養(yǎng)豬專業(yè)合作社）、長白豬（華中農(nóng)業(yè)大學試驗豬場）前腔靜脈采血，采用傳統(tǒng)的苯酚/氯仿提取法提取DNA。

PK細胞由動物胚胎與分子育種湖北省重點實驗室保存（采用含10%熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2孵箱內(nèi)37 ℃常規(guī)培養(yǎng)）。PGL3-Basic載體購自Promega公司;限制性內(nèi)切酶、連接酶購自TaKaRa公司;DMEM培養(yǎng)基、Lipofection AMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 ?啟動子的擴增與克隆測序

根據(jù)豬染色體序列設計引物TF/TR，TF：CCTGGGAGGGAAGGTCAA，TR：CTGGGCTTTGTGC

TCTGTC，引物由北京奧科生物有限公司合成。以大白豬基因組DNA作為啟動子克隆的反應模板，PCR擴增體積為25 μL，體系中各組分的濃度為50 ng模板DNA、1×PCR mix、0.5 mmol/L引物，PCR的運行程序為：預變性94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán);最后72 ℃繼續(xù)延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的條帶用Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，回收后的PCR產(chǎn)物片段與pMD-18T Vector System連接并轉(zhuǎn)化DH5α，重組克隆子送北京奧科生物有限公司測序。

1.3 ?缺失片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)軟件Proscan的預測結(jié)果及人TCAP基因啟動子結(jié)構(gòu)，設計7對引物（表1），構(gòu)建7個缺失片段，并在引物中引入XhoⅠ和MluⅠ酶切位點，反應體系與程序同上。將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和MluⅠ酶切后連接到PGL3-Basic載體中轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序鑒定。

1.4 ?細胞轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)的PK細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，接種于24孔板中，培養(yǎng)至50%～60%融合后，在清潔的EP管中用無血清培養(yǎng)基OPTI-DMEM稀釋1 μL 質(zhì)粒DNA至60 μL，加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫下孵育5～10 min，同時用l mL PBS清洗24孔板中的細胞1次，EP管中加入350 μL含20% FBS血清的細胞培養(yǎng)基，吹打2次混勻后，立即加入到24孔板中，輕輕搖勻后置于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)6 h，吸走含轉(zhuǎn)染復合物的培養(yǎng)基，并用l mL PBS清洗細胞1次，裂解并收集細胞進行熒光素酶活性檢測。

1.5 ?熒光素酶活性測定

徹底吸取各孔培養(yǎng)基，然后用PBS沖洗3遍，每孔加入細胞裂解液110 μL，冰上孵育30 min，刮下細胞并迅速收集到冰預冷的1.5 mL微量離心管中。4 ℃ 12 000 r/min離心2 min，取上清液。將熒光素酶底物分析緩沖液和收集的上清液置于室溫。取10 μL熒光素酶底物和50 μL細胞裂解液加入96孔板，輕輕混勻后迅速放入HTS7000多孔板閱讀器。在激發(fā)波長為430 nm、發(fā)射波長為550 nm條件下讀取熒光值。

1.6 ?數(shù)據(jù)分析

熒光素酶活性測定3次重復，結(jié)果以x±s來表示，用t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05視為差異顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?豬TCAP基因啟動子擴增結(jié)果

以大白豬、長白豬、梅山豬基因組DNA為模板，利用引物TF/TR進行PCR反應，獲得1 662 bp的序列（圖1），經(jīng)過序列比對和啟動子預測軟件分析，確定得到的序列為豬TCAP基因的啟動子序列。

2.2 ?豬TCAP基因啟動子缺失片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以大白豬TCAP基因啟動子區(qū)擴增產(chǎn)物的克隆菌液為模板，利用上游引物GSP分別與下游引物1-7進行擴增，獲得7個大小分別為99、155、310、546、912、1 140、1 428 bp的片段（圖2），產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和MluⅠ酶切純化后，連接到經(jīng)同樣酶切的PGL3-Basic載體中轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切（圖3）和測序鑒定，證實插入片段為目的片段。

2.3 ?TCAP基因啟動子活性分析

將帶有TCAP基因啟動子不同區(qū)段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK細胞，測定熒光素酶活性（圖4）。結(jié)果表明，與陰性對照PGL3-Basic空載體相比，7個不同缺失片段重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性提高了60～130倍，說明這7個片段均具有轉(zhuǎn)錄活性。插入片段長度為155 bp的質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)錄活性最高（P<0.05），說明TCAP基因啟動子核心區(qū)域位于翻譯起點上游0～155區(qū)域。

3 ?討論

隨著新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，研究新基因的功能是當前的熱點，研究基因的表達調(diào)控是基因功能研究的一個內(nèi)容。闡明基因表達調(diào)控的機制，不但可以深入了解生物的生長發(fā)育調(diào)控，而且對于轉(zhuǎn)基因的研究也具有十分重要的意義。啟動子區(qū)的克隆是對基因表達調(diào)控進行研究的必要條件，通過啟動子研究，許多新基因功能在信號傳導等重要調(diào)節(jié)過程的地位被逐漸挖掘出來。TCAP基因是調(diào)控肌原纖維組裝的重要調(diào)控基因之一，研究表明該基因與動物的肌肉發(fā)育等性狀存在顯著的相關[9]，因此克隆該基因的表達調(diào)控區(qū)域，研究該基因的表達調(diào)控模式，為深入研究該基因功能和其在生產(chǎn)中的應用提供理論基礎。

對TCAP基因翻譯起始位點上游1 662 bp DNA序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中含3個可能的啟動子區(qū)域，以及MyoD、C/EBP、STAT、MEF2等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點;在翻譯起點上游0～155 bp范圍內(nèi)存在正調(diào)控因子MyoD、MEF2的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。根據(jù)預測結(jié)果與重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點構(gòu)建了7個缺失載體，研究結(jié)果顯示該基因的核心啟動子區(qū)域位于翻譯起點上游0～155區(qū)域內(nèi)，這與該區(qū)域存在正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的結(jié)果一致，并與Proscan軟件預測結(jié)果相吻合。

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