研究報(bào)告

黃連解毒湯對(duì)小鼠酒精性脂肪肝的預(yù)防作用

王睿林1，李曉娟2，白云峰1，王立福1，李蓓2，李永綱1，李瑞生2

(1. 解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京100039；

2. 解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京100039)

【摘要】目的研究黃連解毒湯(HLJDT)對(duì)小鼠酒精性肝損傷的預(yù)防作用，為黃連解毒湯臨床防治酒精性肝病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法選取60只C57小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和HLJDT低、中、高劑量(0.61、1.22、2.44 g/kg/d)模型組，每組各12只。模型組用50%乙醇灌胃，同時(shí)采用HLJDT進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，6周后，對(duì)各組小鼠的體質(zhì)量、肝指數(shù)、血清生化指標(biāo)以及肝臟和結(jié)腸的病理學(xué)改變進(jìn)行綜合對(duì)比分析。結(jié)果HLJDT各劑量模型組小鼠的體重增長(zhǎng)量均顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)，同時(shí)HLJDT各劑量模型組能顯著降低血清ALT、AST和TG的含量(P<0.05)。病理結(jié)果顯示HLJDT各劑量均對(duì)酒精性肝損傷有顯著的改善作用，且從低劑量到高劑量組對(duì)腸粘膜通透性具有遞增的改善作用。結(jié)論黃連解毒湯可顯著降低腸粘膜的通透性，對(duì)小鼠酒精性肝損傷具有一定的預(yù)防保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】黃連解毒湯；酒精性脂肪肝；小鼠

[基金項(xiàng)目]解放軍第302醫(yī)院院長(zhǎng)創(chuàng)新基金(YNKT2013026)。

[作者簡(jiǎn)介]王睿林(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療研究，E-mail： wrl7905@163.com；李曉娟(1980-)，女，碩士，E-mail： sxlily55@163.com。并列為第一作者。

[通訊作者]李瑞生(1969-)，男，博士，副研究員，從事人類疾病動(dòng)物模型研究，E-mail： lrsheng@sohu.com；李永綱(1965-)，男，碩士，主任醫(yī)師，從事傳染病學(xué)研究，E-mail： lyg100039@sina.com。

【中圖分類號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.009

Preventive effects of Huanglian Jiedu Decoction on

alcoholic fatty liver in mice

WANG Rui-lin1，LI Xiao-juan2，BAI Yun-feng1，WANG Li-fu1，LI Bei2，LI Yong-gang1，LI Rui-sheng2

(1. Liver Disease Center for Combined TCM and Western Medicine，

2. Research and Technology Service Center，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China)

Abstract【】ObjectiveTo study the preventive effect of a Chinese traditional medicine, Huanglian Jiedu Decoction (HLJDT), on alcoholic fatty liver in mice, and provide experimental evidence for clinical prevention and treatment of alcoholic liver disease. Methods Sixty healthy SPF male C57 mice were randomly divided into control group, model group and low, medium and high dose HLJDT(0.61, 1.22, 2.44 g/kg/d)groups, 12 mice in each group. The mice of model groups were given gastric gavage of 50% ethanol, combined with concomitant HLJDT intervention for 6 weeks. The mice of control group received the same volume of saline. The body weight, liver index, serum biochemical indexes were determined and histopathological changes in the liver and colon tissues were examined and analyzed at 6 weeks after the experiment. ResultsBody weight gains of the mice in all the three dose HLJDT groups were significantly higher than that of the control group (P<0.05)，liver index and the serum ALT, AST and TG contents were significantly decreased (P<0.05 for all). Histological changes in the liver of all the three dose HLJDT groups were significantly milder than those of the model control group, and also improving of the colon mucosal alterations was observed in the three dose HLJDT groups in a dose-dependent manner. ConclusionsHuanglian Jiedu Decoction can well reduce the permeability of intestinal mucosa, and exerts certain preventive and protective effects on alcoholic liver injury in mice.

【Key words】Huanglian Jiedu decoction; Alcoholic fatty liver; Mice

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是一種進(jìn)行性發(fā)展且后期會(huì)嚴(yán)重危害身體健康甚至威脅生命的消化系統(tǒng)疾病。其致病因素單一而明確，主要是長(zhǎng)期大量飲酒所造成的，但其發(fā)病機(jī)制卻十分復(fù)雜[1]。近年來(lái)酒精致腸粘膜通透性增加，腸道內(nèi)毒素滲漏入血及其激活肝Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子機(jī)制，是酒精性肝損傷機(jī)理研究的熱點(diǎn)之一[2,3]。而黃連解毒湯(HLJDT)是由黃連、黃柏、黃芩、桅子四味藥組成的清熱解毒的代表方，具有瀉火解毒之功效，主治實(shí)熱火毒，三焦熱盛之證[4]。目前國(guó)內(nèi)研究證實(shí)黃連解毒湯具有抗內(nèi)毒素、抗肝損傷、抗炎、抗氧化及降血脂等生物活性的作用[5]，但將黃連解毒湯用于干預(yù)小鼠酒精性肝損傷的研究國(guó)內(nèi)外還尚未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)黃連解毒湯對(duì)酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)、生化指標(biāo)以及肝臟和結(jié)腸組織病理學(xué)結(jié)果的影響，來(lái)探討黃連解毒湯對(duì)酒精性肝損傷的干預(yù)作用，以期為酒精性肝病的預(yù)防和臨床治療提供新的思路。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇SPF級(jí)C57小鼠，60只，雄性，單鼠體質(zhì)量為(20～22)g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0004】。在302醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，其使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

乙醇(分析純，純度>99.7%)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130315)；生理鹽水(解放軍第302醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：130527405，石家莊四藥有限公司)；黃連解毒湯顆粒由解放軍302醫(yī)院藥劑室制備。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與灌胃劑量

60只C57小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃連解毒湯顆粒高劑量組(2.44 g/Kg)、中劑量組(1.22 g/kg)、低劑量組(0.61 g/kg)等五組，每組各12只。黃連解毒湯的劑量根據(jù)人臨床劑量換算，換算公式：小鼠劑量(g/kg)=9.1 × 人臨床劑量(0.067 g/kg)。此劑量作為低劑量，中劑量與高劑量分別為低劑量的2倍和4倍。每日不同劑量模型組灌服不同劑量的黃連解毒湯，對(duì)照組采用相同劑量的生理鹽水灌胃，30 min后[6]，空白對(duì)照組灌服生理鹽水，其他組灌服50%乙醇，劑量為12 mL/kg，連續(xù)灌服6周[7]。且根據(jù)每周體重的變化來(lái)調(diào)整黃連解毒湯和乙醇的灌胃量。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

每天觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠的活動(dòng)情況，采血前禁食12 h后，經(jīng)小鼠眶后靜脈叢采血，離心后取血清檢測(cè)各組小鼠的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)和甘油三酯(TG) 等三個(gè)生化指標(biāo)。然后再迅速取各組小鼠的肝臟組織，稱重，并計(jì)算其肝指數(shù)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g) × 100%；同時(shí)再采集所有小鼠同一部位的肝組織和一段結(jié)腸組織，用4%的甲醛固定，HE染色后，分析各組小鼠肝臟和結(jié)腸組織的病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 17.0軟件的方差分析方法對(duì)各組小鼠的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異顯著性。

2結(jié)果

2.1各組小鼠體重增長(zhǎng)量、肝指數(shù)及生化指標(biāo)的分析

通過(guò)對(duì)各組小鼠體重增長(zhǎng)量、肝指數(shù)和生化指標(biāo)的對(duì)比分析顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠的體重增長(zhǎng)量顯著降低(P<0.05)，肝指數(shù)顯著增加(P<0.05)，血清ALT、AST和TG也顯著增高(P<0.05)；而與模型對(duì)照組相比，HLJDT各劑量組小鼠的體重增長(zhǎng)量均顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量明顯降低(P<0.05)，其中HLJDT對(duì)ALT和TG含量的影響呈現(xiàn)出劑量依賴性(表1)。

表1　各組小鼠體重增長(zhǎng)量、肝指數(shù)和生化指標(biāo)分析

注：與空白對(duì)照組相比*P<0.05；與模型對(duì)照組相比△P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with the control group；△P<0.05, compared with the model group.

2.2各組小鼠肝臟病理學(xué)分析

空白對(duì)照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列規(guī)則且以中心靜脈放射排列，匯管區(qū)未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組小鼠肝小葉界限模糊，肝細(xì)胞內(nèi)有成堆的脂肪滴，呈典型的酒精性脂肪病變。而灌服黃連解毒湯各劑量模型組小鼠的脂肪變和肝細(xì)胞腫脹程度均比模型對(duì)照組明顯減輕，各劑量組小鼠肝細(xì)胞均觀察不到成堆的脂肪滴出現(xiàn)，肝小葉及匯管區(qū)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1，見文后彩插8)。

2.3各組小鼠結(jié)腸病理學(xué)分析

結(jié)腸病理學(xué)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸粘膜層次清晰，表面光滑、整齊，粘膜上皮和腺體結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞與固有層間緊密連結(jié)；模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞脫落，上皮細(xì)胞與固有層間距顯著增寬，腺體結(jié)構(gòu)破壞，隱窩變淺，粘膜下層水腫；而灌服黃連解毒湯模型組從低劑量到高劑量，其腸粘膜層次較模型對(duì)照組清晰，上皮細(xì)胞與固有層間距從疏散變?yōu)榫o密連結(jié)，結(jié)腸粘膜層次漸變清晰，且表面漸變整齊光滑(圖2，見文后彩插8)。

3討論

酒精性肝病的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞等)和多種有害因子(內(nèi)毒素、氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子等)[8]。眾所周知，內(nèi)毒素(LPS)是腸道革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的脂多糖，具有高度的免疫活性并能誘導(dǎo)大量炎性介質(zhì)產(chǎn)生[9]。研究發(fā)現(xiàn)乙醇可導(dǎo)致腸道血管通透性增加，使內(nèi)毒素腸滲漏入血，轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟與Kupffer細(xì)胞相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的多種細(xì)胞因子從而引起肝細(xì)胞凋亡[10]。因此內(nèi)毒素血癥和內(nèi)毒素介導(dǎo)的肝細(xì)胞損害在酒精性肝病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[11]。聶嬌等[12]也發(fā)現(xiàn)在小鼠酒精性肝病造模過(guò)程中腸粘膜通透性增加，從而加劇了肝臟的損傷程度。而方志紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)健脾理氣活血方在大鼠體內(nèi)能夠通過(guò)降低腸粘膜通透性，從而影響內(nèi)毒素滲漏而對(duì)酒精性肝損傷發(fā)揮干預(yù)作用。而國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)黃連解毒湯是否能夠通過(guò)抑制腸粘膜通透性而發(fā)揮抗內(nèi)毒素作用，從而對(duì)酒精性肝病發(fā)揮干預(yù)作用的報(bào)道。

因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用黃連解毒湯對(duì)酒精中毒小鼠干預(yù)6周觀察其抗酒精性肝損傷的作用，各組小鼠體重增長(zhǎng)量和肝指數(shù)以及生化指標(biāo)結(jié)果顯示：黃連解毒湯各劑量組結(jié)果與模型對(duì)照組相比，小鼠體重增長(zhǎng)量顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)顯著降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明了黃連解毒湯能夠顯著改善酒精中毒小鼠的食欲，增強(qiáng)腸道營(yíng)養(yǎng)吸收功能，能夠顯著降低血清轉(zhuǎn)氨酶的濃度，具有較強(qiáng)的修復(fù)酒精性肝臟損傷的效應(yīng)；同時(shí)黃連解毒湯各組能夠顯著降低血清TG的含量，此結(jié)果與其具有抗血脂的結(jié)果相一致[14]。而肝臟病理學(xué)檢查是判斷肝臟損傷的金標(biāo)準(zhǔn)[15]，本實(shí)驗(yàn)肝臟病理學(xué)結(jié)果顯示三種劑量的黃連解毒湯對(duì)酒精性肝損傷均具有顯著地改善作用，但不具有顯著的劑量依從性，與生化指標(biāo)的劑量依從性不具有一致性，可能是由于肝臟病理改變與生化指標(biāo)變化的靈敏度不同造成的。由于腸道革蘭氏陰性桿菌多存在于大腸部位，因此本實(shí)驗(yàn)選擇觀察結(jié)腸通透性的病理學(xué)改變，結(jié)腸病理學(xué)結(jié)果顯示模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞與固有層間距增寬，腺體結(jié)構(gòu)破壞，說(shuō)明了酒精進(jìn)入體內(nèi)蓄積可誘發(fā)腸粘膜的損傷，而黃連解毒湯從低劑量到高劑量對(duì)腸粘膜具有遞增的改善和保護(hù)作用，可推斷黃連解毒湯通過(guò)降低腸粘膜的通透性而影響了內(nèi)毒素的吸收，對(duì)酒精性肝損傷出現(xiàn)的脂肪變性具有抑制和減緩發(fā)展的作用，從而發(fā)揮抗酒精性肝損傷的效應(yīng)，而血清內(nèi)毒素的測(cè)定以及黃連解毒湯對(duì)酒精性脂肪肝的其它作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究和證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了黃連解毒湯可顯著通過(guò)降低腸粘膜通透性從而可能會(huì)影響內(nèi)毒素的吸收，對(duì)小鼠酒精性肝損傷具有一定的預(yù)防保護(hù)作用，為今后深入研究黃連解毒湯及其有效成分的藥理學(xué)作用，以及在臨床上治療ALD疾病具有十分重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]李愛華, 趙剛. 酒精性肝病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]．吉林醫(yī)學(xué), 2010, 31(17): 2670-2672．

[2]郭萌, 李冠民, 黃清泉. 細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2009, 17(5): 397-401．

[3]李守超, 袁丁, 王洪武. 肝臟免疫系統(tǒng)在酒精性肝損傷中的作用啟示 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 12(4): 748-750．

[4]唐曉玲, 唐敏. 黃連解毒湯臨床研究進(jìn)展 [J]. 實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床, 2010, 10(5): 90-91．

[5]張鵬暉, 張建亭. 黃連解毒湯藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 浙江中醫(yī)雜志, 2012, 47(6): 458-460．

[6]白云峰, 李曉娟, 李永綱, 等. 近交系小鼠酒精性脂肪肝模型建立的分析 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(1): 8-11．

[7]付萍, 楊銘, 陳穎麗, 等. 玉米肽對(duì)小鼠酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技, 2008, 15(2): 115-116．

[8]丁曉東. 酒精性肝病肝損傷的信號(hào)通路 [J]. 肝臟, 2012, 17(4): 269-271.

[9]Enomoto N, Takei Y, Yamashina S, et al. Anti-inflammatory strategies in alcoholic steatohepatitis [J]. Gastroenterol Hepatol, 2007, 22(Supp11): 559．

[10]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組. 中國(guó)酒精性肝病診療指南(2010年1月修訂)[M]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2011, 27(6): 801-803.

[11]Cohen JI, Nagy LE. Pathogenesis of alcoholic liver disease: interactions between parenchymal and non-parenchymal cells [J]. Dig Dis, 2011, 12(1): 3-9．

[12]聶嬌, 李鑫, 徐有青. 內(nèi)毒素在酒精性肝病腸損傷中的作用 [J]．實(shí)用肝臟病雜志, 2012, 15(3): 206-208．

[13]方志紅, 胡義揚(yáng), 崔劍巍, 等. 大鼠酒精性肝損傷與腸內(nèi)毒素滲漏的關(guān)系及健脾理氣活血方的干預(yù)作用 [J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2006, 26(9): 813-817.

[14]宋玨, 路通, 謝林, 等. 黃連解毒湯抗氧化作用的血清藥理學(xué)研究 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010, 16(4)4: 118-122.

[15]向志鋼, 李先輝, 劉鋒, 等. 果王素對(duì)小鼠酒精性肝病保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J]．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20(3): 373-376．

〔修回日期〕2014-12-09