技術方法

創(chuàng)傷較小的小鼠主動脈弓縮窄術的建立

廉洪建， 馮玄超， 啜文靜， 薛曉興， 王偉，郭淑貞

(北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京100029)

【摘要】目的探索一種對小鼠創(chuàng)傷較小的主動脈弓縮窄術的手術方法。方法 32只雄性昆明(KM)小鼠，隨機分為假手術10只及模型(主動脈弓縮窄術)組22只；模型組動物麻醉后仰臥位固定，行氣管插管接通呼吸機。右側臥位重新固定，左側第二肋間開胸，分離主動脈弓并用5-0真絲編織線將其套扎在26G注射器針頭行縮窄操作，縮窄后退出針頭，關胸。假手術組動物同期行開胸，而不進行縮窄操作，其余操作步驟與模型組相同。造模期間及造模后4周記錄動物死亡情況；于術后4周對兩組小鼠行心臟超聲及心臟病理學檢測。結果①模型組總死亡率約為32%。②超聲心動圖結果：模型組主動脈弓縮窄處血流速率均大于2 400 mm/s；假手術組主動脈弓縮窄處血流速率均小于900 mm/s。與假手術組比較，模型組左室收縮末期內徑(LVSD)、左心室收縮期容積(LVSV)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)明顯增加(P<0.05)；射血分數(shù)(EF)、左心室縮短分數(shù)(FS)顯著降低(P<0.05)。③病理切片可見血管擴張及血管壁增厚表現(xiàn)。結論本造模方法能夠成功增加心臟后負荷，誘導后負荷增加所致的心肌肥厚病理生理過程。與國內報道較多的劈開胸骨的造模方法相比，該造模方法對模型動物的損傷更小，在與心肌肥厚病理生理機制及相關藥效研究中具有很大的應用價值。

【關鍵詞】主動脈弓縮窄；左室肥厚；壓力超負荷；小鼠

[基金項目]國家自然科學基金(81102829)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-13-0692)。

[作者簡介]廉洪建(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結合防治心血管疾病的應用基礎研究。

[通訊作者]王偉，男，博士，教授，博士生導師；郭淑貞，女，副教授，碩士生導師，E-mail： ss3008@126.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.011

Establishment of a mouse model of transverse aortic

constriction with less invasive injury

LIAN Hong-jian, FENG Xuan-chao, CHUO Wen-jing, XUE Xiao-xing, WANG Wei, GUO Shu-zhen

(School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Abstract【】ObjectiveTo explore a method of establishment of a mouse model of transverse aortic constriction(TAC) with less invasive injury. Methods Thirty-two male KM mice were randomly divided into two groups: sham-operation(SH) group (n=10)and transverse aortic constriction(TAC)group(n=22).Mice of the TAC group were placed in a supine position under anesthesia. The endotracheal intubation tube was then connected on a rodent ventilator.After that,the mice were replaced in the right lateral decubitus position. Thoracotomy was performed to the second rib and to separate the transverse aorta. A 26G blunt needle was inserted into thetransverse aorta, and a small piece of 5-0 silk thread was used to tightly ligate the needle inserted in the transverse aorta. The same operation was performed on the mice of sham group, except for the ligation of the transverse aorta. Then the open chest was closed and the skin was sutured. The death of mice during and post operation was recorded. Echocardiographic assessments,heart weight and histological examination of the myocardium were performed at 4 weeks after surgery.Results① The total death rate of TAC modeling was 32%. ②The blood flow velocities of the ligation of transverse aorta were all above 2400 mm/s in the TAC group，but all bellow 900 mm/s in the SH group. Compared with that in the sham operation group, the LVSD, LVDV,LVM, and LVMI were significantly increased (P<0.05), and the EF and FS were significantly decreased in the TAC group (P<0.05).③Histopathological examination showed vascular dilation and thickening of the blood vessel wall. ConclusionsThe method of establishing a mouse model of transverse aortic constriction can successfully induce pressure overload, resulting in myocardial hypertrophy and heart failure. Compared with the widely reported literature in our country, this method does not need to split the sternum and causes less invasive injury. Therefore, it may have good application value in myocardial hypertrophy-related pathophysiological and pharmacodynamics studies.

【Key words】Transverse aortic constriction;Left ventricular hypertrophy; Pressure overload; Heart; Mice

主動脈弓縮窄術( transverse aortic constriction，TAC) 所致的壓力超負荷所致的心肌肥厚模型是一種較為常用的研究心肌肥厚病理生理過程的動物模型[1]，其常用于心血管相關藥物、分子生物學研究[2]。由于轉基因技術的發(fā)展，采用小鼠作為實驗動物研究心血管疾病逐漸得到更多的運用，所以小鼠主動脈弓縮窄術具有特別的意義。但由于小鼠血管細小且位置較深，手術操作難度大且容易引起出血導致死亡。國內關于小鼠主動脈弓縮窄術方法文獻較少，其中多以前正中線劈開胸骨后開胸的操作方法常見[3, 4]。這種手術操作方法對實驗動物創(chuàng)傷較大。本研究介紹一種無需劈開胸骨進行主動脈弓縮窄的手術方法，并通過對能夠反映心功能的超聲指標的檢測，以驗證該造模方法的可靠性。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及分組：4周齡SPF級雄性昆明(KM)小鼠32只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[生產(chǎn)許可證號： SCXK(京)2012-0001]；隨機分為假手術10只及主動脈弓縮窄術組22只，并于術后觀察4周。實驗動物使用許可證號：SYXK (京) 2011-0024。

1.1.2主要儀器：小動物呼吸機(SAR-1000 ventilator美國)、鵝頸冷光源、小鼠外科顯微手術器械、Vevo2100超聲儀(Visual Sonics加拿大)。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型的制備：

1.2.1.1稱重與麻醉：雄性昆明(KM)小鼠(25 g～30 g)稱重，經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。

1.2.1.2固定、氣管插管和機械通氣：麻醉后，用PE膠帶將小鼠四肢仰臥位粘固于自制小鼠板上，門齒用細線固定以保持氣道通暢。將固定小鼠的鼠板水平置于桌面上，頸部放置冷光源鵝頸燈照明；用壓舌板輕輕將舌牽引至口腔外，隨后將壓舌板抵住舌根輕柔向上提，可見冷光源照射下的咽部有明顯的圓形亮點即為氣管開口；將自制氣管插管(22G靜脈套管針外鞘作為氣管插管)緩緩插入氣管，隨后接通呼吸機即可；呼吸頻率90～100次/min，潮氣量0.3～0.4 mL。(氣管插管成功時，小鼠胸廓呼吸頻率與呼吸機頻率相同，腹部無異常起伏。)成功操作氣管插管后，將小鼠重新固定為右側臥位，小鼠左側上肢方向指向頭部方向固定，以求充分暴露胸廓。

1.2.1.3開胸:胸廓碘伏消毒，于小鼠左側第二肋間隙逐層開胸，開胸切口大小約為7 mm；用自制拉鉤固定切口并充分暴露胸腔內的心、肺、胸腺、脂肪等組織；分離胸腺與脂肪以暴露主動脈弓；用尖部磨制較細的無齒彎鑷沿胸腺與脂肪間輕輕分離，逐漸顯露隱藏在胸腺與脂肪后的主動脈弓(該過程需輕柔、緩慢)，以便充分暴露無名動脈與左側頸總動脈的分叉處，右手持經(jīng)彎鑷改制的鉤狀彎鑷從無名動脈與左側頸總動脈的分叉處對側輕輕探入，包繞過主動脈弓后壁，從無名動脈與左側頸總動脈的分叉處探出并夾持5-0真絲編織線，隨后將夾持5-0真絲編織線的鉤狀彎鑷提出使得絲線包繞過主動脈弓；將自制的“L”形26G墊扎針置于主動脈弓垂直上方，隨后夾持真絲編織線的兩端捆扎在該墊扎針上，打結后將墊扎針輕輕退出，剪斷結旁多余線頭，完成主動脈弓縮窄。假手術組動物僅行開胸操作，而不進行縮窄操作，其余操作步驟與模型組相同。

1.2.1.4關胸:用4-0帶線縫合針逐層關胸、縫皮。切口消毒。

1.2.1.5脫離呼吸機:縫合后，進行試驗性脫離呼吸機而保留氣管插管。若脫機后小鼠呼吸平穩(wěn)正常，則可以完全脫機；若小鼠呼吸緩慢，可以適當延長脫機時間。

1.2.1.6術后處理及日常記錄:術后防止小鼠體溫過低要將小鼠置于電熱毯上，待其蘇醒后放入飼養(yǎng)籠中并給與飲水。記錄術中及術后兩組動物的死亡數(shù)量，同時解剖并記錄死亡原因。

1.2.2超聲心功能評價方法及觀察指標:使用Vevo2100超聲儀(Visual Sonics加拿大)及配置的相應探頭(MS-400型號)，中心頻率30MHz,標準幀頻449fps，于術后4周行心臟超聲檢查。胸部褪毛,異氟烷呼吸麻醉,仰臥位。于主動脈弓切面行彩色多普勒獲得其血流圖像；于左胸骨旁短軸切面，左心長軸切面獲得左心室M型超聲心動圖和左心室二維圖像。長軸及短軸切面下，每一測量點記錄10個心動周期;獲得左室收縮末期內徑(LVIDs)、左室舒張末期內徑(LVIDd)、左室后壁收縮期厚度(LVPWs)、左室后壁舒張期厚度(LVPWd)、左室前壁舒張末期厚度(LVAWd)、左室前壁收縮末期厚度(LVAWs)、計算左室短軸縮短率(FS% )、左心室射血分數(shù)(LV ejection fraction, EF%)、左心室舒張期容積(LVDV)、左心室收縮期容積(LVSV)、左心室心肌質量(LV mass)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)。

1.2.3病理組織學檢測:將心臟沿水平切面切取上下兩部分，下部分組織經(jīng)多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.4統(tǒng)計學方法：計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包,兩組間采用獨立樣本t檢驗比較分析。

2結果

2.1TAC小鼠模型的存活率及并發(fā)癥

我們在實驗中觀察到，主動脈弓縮窄術術中及術后死亡原因主要是主動脈弓破裂及大血管損傷。手術操作過程中及術后24 h模型組死亡4只，成活18只，術后存活率約為82%；術后4周模型組總計死亡7只，存活15只，模型組存活率約為68%。術后4周假手術組共計死亡0只，存活10只；

2.2超聲結果

術后4周，主動脈弓切面下，模型組動物無名動脈與左側頸總動脈間可見縮窄線；主動脈弓縮窄處血流速率超過2 400 mm/s；假手術組血流速率均低于900 mm/s。結果表明該手術模型能夠顯著增加心臟后負荷。術后4周模型組與假手術組比較：左室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室收縮期容積(LV Vol;s)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)明顯增加(P<0.05)；射血分數(shù)(EF)、左心室縮短分數(shù)(FS)顯著降低(P<0.05)。結果表明：模型組動物心臟重量增加、順應性降低，心功能有所下降。左室后壁收縮期厚度(LVPWs)、左室前壁舒張末期厚度(LVAWd)、左室前壁收縮末期厚度(LVAWs) 差異無明顯意義(表1)；

2.3組織形態(tài)學結果

術后4周，模型組與假手術組相比，動脈血管管腔變大，血管壁增厚，血管壁外側結締組織增生，向附近心肌組織滲透。心肌細胞較為肥大，心肌纖維束增寛，心肌纖維外的成纖維細胞增多；假手術組，心肌細胞無肥大，心肌纖維外的成纖維細胞無異常增多；動脈無擴張及血管壁增厚表現(xiàn)(圖1,見封二)。

3討論

主動脈弓縮窄術小鼠模型是還原壓力超負荷導致心肌代償性肥大到失代償性心衰病理生理發(fā)展過程的理想模型，造模過程略微復雜，但病變程度可控，模型穩(wěn)定、重復性好。

表1　術后4周心臟彩超指標變化(-x±s)

注: 模型組與假手術組比較，*P<0.05；

Note. TAC group vs.sham-operation group*P<0.05.

本實驗結果中，模型組動物主動脈弓縮窄處血流速率超過2 400 mm/s；假手術組血流速率均低于900 mm/s。結果表明該手術模型已經(jīng)成功的引起了心臟后負荷的增加。國外文獻報道，嚴重的主動脈弓縮窄術后3 d即可出現(xiàn)左室肥厚[5]，其心肌肥厚的進展速度與縮窄的嚴重程度有關。本實驗中，術后4周模型組超聲結果左室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室收縮期容積(LVDV)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)均明顯增加，提示了心臟重量增加，心功能有所下降，符合相關文獻報道。模型組動物組織形態(tài)學可見血管和心肌細胞的病理變化，包括血管管腔變大，血管壁增厚，血管壁外側結締組織增生，并向附近心肌組織滲透；心肌細胞肥大，心肌纖維束增寛，心肌纖維外的成纖維細胞增多等表現(xiàn)。其表現(xiàn)均屬心肌肥厚的病變表現(xiàn)，進一步證實該方法能夠可靠的增加心臟后負荷，并誘導心肌肥厚的發(fā)生。

根據(jù)筆者實驗中的體會，該造模方法中應當重點注意以下操作步驟：(1)若遇到特殊情況，氣管插管3次不成功時，不可繼續(xù)嘗試，防止術后喉頭水腫導致窒息死亡。(2)開胸階段避免損傷乳內動脈引起大失血。(3)分離主動脈弓及穿線時，動作務必輕柔緩慢，防止器械劃傷大血管及重要組織。(4)在縮窄點行縮窄操作時，結扎力度應松緊適當，力度過緊容易導致主動脈弓破裂出血。(5)關胸縫合時，避免損傷肺臟、大血管等。

本造模方法與國內多數(shù)文獻報道的劈開胸骨后行縮窄術的方法不同，其術后存活率雖與國內報道的其他手術方法存活率相當[6]，但該方法無需劈開胸骨進入胸腔，而僅是將小鼠右側臥位以左側第二肋間隙直接開胸，從而極大的減少了對實驗動物骨骼及胸腺等部位組織的損傷。除此之外，實驗動物術后體能恢復很快，術后蘇醒后即可自由活動，飲食飲水，無需實驗人員特殊護理，不會增加實驗人員的工作量。該造模方法尚具有操作步驟簡單、操作時間短等優(yōu)點，在與心肌肥厚病理生理機制及相關藥效研究中具有很大的應用價值。

參考文獻：

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〔修回日期〕2014-11-15