■高肖微 齊遵利 張秀文

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島 066003）

在飼料中添加抗生素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和疾病預(yù)防有一定的促進(jìn)作用，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，破壞動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)平衡，使動(dòng)物體非特異性免疫能力下降[1-2]。近幾年人們一直在尋找抗生素的替代品，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）具有促進(jìn)腸道內(nèi)厭氧菌的生長(zhǎng)、抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖、調(diào)整腸道菌群平衡和促進(jìn)食物消化吸收的作用，并且滿足耐高溫、耐酸堿等飼料加工特性，具有無(wú)殘留、無(wú)毒副作用，避免了使用抗生素的一些弊端。研究地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑的使用越來(lái)越引起人們的重視。本試驗(yàn)在鯉魚(yú)飼料中添加地衣芽孢桿菌，探討其對(duì)鯉魚(yú)生長(zhǎng)性能、非特異性免疫酶活性的影響，為地衣芽孢桿菌在鯉魚(yú)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用鯉魚(yú)來(lái)自天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)。試驗(yàn)魚(yú)先暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間，投喂飼料為基礎(chǔ)飼料，以鯉魚(yú)出現(xiàn)有規(guī)律攝食為馴化指標(biāo)。試驗(yàn)用地衣芽孢桿菌來(lái)自江蘇納克生物工程有限公司，活菌數(shù)為3×1010cfu/g。

2 方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

試驗(yàn)在110 cm×45 cm×60 cm的水族箱內(nèi)進(jìn)行。將地衣芽孢桿菌按照0%（對(duì)照組）、0.05%（A1）、0.1%（A2）、0.2%（A3）的比例加入到基礎(chǔ)飼料中制成試驗(yàn)飼料，每組3個(gè)平行，每個(gè)水族箱內(nèi)放20尾試驗(yàn)魚(yú)。每天08:30、12:30和16:30定時(shí)投喂，投喂量約為體重的3%。每天檢查鯉魚(yú)的攝食、發(fā)病或死亡情況，做好記錄。水溫控制在25℃左右，根據(jù)水質(zhì)情況適當(dāng)換水，每次換水量為1/5。連續(xù)投喂60 d。

2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)正式開(kāi)始后，分別測(cè)定對(duì)照組和試驗(yàn)組的鯉魚(yú)初始體重，飼喂60 d后，停食1 d，空腹測(cè)定終末體重。計(jì)算各組魚(yú)的相對(duì)增重率和飼料系數(shù)。

飼料系數(shù)（CF）=飼料消耗量/魚(yú)的增重量；

相對(duì)增重率（%）=（試驗(yàn)?zāi)~(yú)平均尾重量－試驗(yàn)初魚(yú)平均尾重量）/試驗(yàn)初魚(yú)平均尾重量×100。

2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)開(kāi)始后在20、40、60 d，從每個(gè)試驗(yàn)處理組隨機(jī)取3尾魚(yú)，用肝素鈉水溶液潤(rùn)洗過(guò)的一次性注射器在魚(yú)的尾靜脈采血2 ml，立即輕輕搖勻，置于4℃冰箱內(nèi)保存。3 000 r/min冷凍離心10 min后，提取血清。24 h內(nèi)測(cè)定完畢。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，1個(gè)SOD活性單位（U）定義：1 ml血清反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)活性單位；溶菌酶（LZM）的活性：在溫度為37℃、波長(zhǎng)為530 nm下，1 min內(nèi)引起吸光度下降0.001為1個(gè)活性單位；過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性定義為：1 ml血清或血漿1 s分解1 μmol的H2O2的量為1個(gè)活性單位（U）；堿性磷酸酶（AKP）活性單位的定義：100 ml血清在37℃與基質(zhì)作用15 min時(shí)產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位；酸性磷酸酶（ACP）的活性：100 ml血清在37℃與基質(zhì)作用15 min時(shí)產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位；谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性采用比色法測(cè)定，以絕對(duì)OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得相應(yīng)的GOT活性單位。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用ANOVA單因素方差分析及Duncan's多重比較法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示，顯著水平為P＜0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表1）

表1 地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表1可知，與對(duì)照組相比，鯉魚(yú)的生長(zhǎng)性能顯著增強(qiáng)（P＜0.05），其中0.1%組效果最好，相對(duì)增重率和飼料系數(shù)分別為156.57%、1.58，且顯著高于A1和A3組（P＜0.05），A1與A3組之間差異不顯著（P＞0.05）。

3.2 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表2及圖1、圖2）

3.2.1 對(duì)SOD的影響

由表2可知，投喂20 d：地衣芽孢桿菌能顯著提高鯉魚(yú)SOD活性（P＜0.05），3個(gè)試驗(yàn)組較對(duì)照組分別提高29.53%、55.5%、47.84%。與A1組相比，A2、A3組顯著提高了鯉魚(yú)抗氧化能力（P＜0.05）；投喂 40 d：試驗(yàn)組SOD活性與對(duì)照組相比較差異顯著（P＜0.05），試驗(yàn)組之間差異顯著（P＜0.05），A2組SOD活性最高，較對(duì)照組高出61.67 U/ml；投喂60 d：3個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05），但是同對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）。

3.2.2 對(duì)LZM的影響

表2 地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)血清SOD、LZM、CAT活性的影響（U/ml）

圖1 地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)血清ACP和AKP活性的影響

圖2 地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)血清GOT活性的影響

由表2可知，投喂20 d：地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)LZM影響較?。≒＞0.05）；投喂40 d：3個(gè)試驗(yàn)組的LZM活性與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），較對(duì)照組提高28.67%、31.96%、33.29%，試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05），添加0.2%地衣芽孢桿菌組效果較好；投喂60 d：試驗(yàn)組同對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），A1與A3差異不顯著（P＞0.05），與A2有顯著差異 （P＜0.05）。A2組LZM活性達(dá)到最高，為88.83 U/ml，較對(duì)照組提高39.87%。

3.2.3 對(duì)CAT的影響

由表2可知，整個(gè)試驗(yàn)期間各個(gè)試驗(yàn)組CAT呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)。投喂20 d：試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），其中A1和A2組CAT活性差異不顯著（P＞0.05），均與A3組CAT活性差異顯著（P＜0.05）；投喂40 d：3個(gè)試驗(yàn)組的CAT活性和對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），A2、A3組CAT活性差異不顯著（P＞0.05）。投喂60 d：4個(gè)組之間CAT活性差異顯著（P＜0.05）。A3組CAT活性達(dá)到最高，為5.87 U/ml，相比對(duì)照組增加了86.35%。

3.2.4 對(duì)ACP和AKP的影響

由圖1可知，對(duì)照組和試驗(yàn)組鯉魚(yú)的ACP和AKP活性，隨著投喂時(shí)間的增加稍微有所增強(qiáng)。ACP活性：投喂20 d，試驗(yàn)組和對(duì)照組ACP活性差異顯著（P＜0.05），A1和 A3差異不顯著（P＞0.05），與 A2差異顯著（P＜0.05）；投喂40 d和60 d效果相同，試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05），但同對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。AKP活性：投喂20 d和40 d試驗(yàn)組和對(duì)照組AKP活性差異顯著（P＜0.05），A1和A3差異不顯著（P＞0.05），與A2差異顯著（P＜0.05）；投喂60 d，試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05），但同對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

3.2.5 對(duì)GOT的影響

由圖2可知，整個(gè)試驗(yàn)期間隨著投喂地衣芽孢桿菌飼料時(shí)間的增加，試驗(yàn)組和對(duì)照組的GOT活性稍有降低或升高，但沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。投喂地衣芽孢桿菌20 d時(shí)，與對(duì)照組相比，除A3組外，A1與A2組稍有升高；40、60 d后，試驗(yàn)組GOT活性呈降低趨勢(shì)。

4 討論

4.1 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)生長(zhǎng)的影響

從表1可以看出，地衣芽孢桿菌添加劑能夠降低飼料系數(shù)，提高試驗(yàn)組鯉魚(yú)相對(duì)增重率。地衣芽孢桿菌隨添加量增加，增重率呈現(xiàn)先增加，而后略有降低的趨勢(shì)；飼料系數(shù)先降低，然后升高。其中添加地衣芽孢桿菌0.1%（A2），增重率最大，飼料系數(shù)最低。這一結(jié)果與劉波等[3]研究地衣芽孢桿菌對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)的影響和華雪銘等[4]研究飼料添加芽孢桿菌對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)及抗病力的影響所得結(jié)果相似。這可能是地衣芽孢桿菌進(jìn)入腸道后產(chǎn)生了多肽、維生素、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、纖維素酶等[5]，這些酶進(jìn)入宿主腸道后，增加宿主內(nèi)源酶數(shù)量和消化酶活性，使動(dòng)物腸道褶皺增多，增強(qiáng)腸黏膜細(xì)胞吸收能力[6]，維持和調(diào)節(jié)魚(yú)體腸道菌群平衡，減少降解膽酸的細(xì)菌數(shù)量[7-8]，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。

4.2 飼料中添加地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)非特異性免疫的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在飼料中添加0.05%～0.2%地衣芽孢桿菌可以顯著提高ACP和AKP活性（P＜0.05），且20 d時(shí)A2組ACP、AKP活性顯著高于A1和A3組（P＜0.05），40 d時(shí)A2組AKP活性顯著高于A1和A3組（P＜0.05），說(shuō)明在飼料中添加地衣芽孢桿菌可以提高鯉魚(yú)免疫力，其中以0.1%添加組效果最好。谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性試驗(yàn)組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明試驗(yàn)采樣鯉魚(yú)的肝胰臟等組織沒(méi)有發(fā)生病變[9]，避免了在魚(yú)患病時(shí)取樣，從而引起非試驗(yàn)條件的生化指標(biāo)的差別，也說(shuō)明在試驗(yàn)期間對(duì)鯉魚(yú)肝胰臟未造成明顯損傷。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：用添加枯草芽孢桿菌的飼料投喂鯉魚(yú)，可以促進(jìn)鯉魚(yú)免疫器官的成熟，增加鯉魚(yú)的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性和抗嗜水氣單胞菌的能力[10]。魚(yú)蝦等生物在抵抗外來(lái)入侵病菌或條件致病菌時(shí)，其非特異性免疫在清除異物時(shí)發(fā)揮著重要作用。研究表明凡納濱對(duì)蝦SOD具有免疫調(diào)節(jié)活性，可以用來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體免疫能力高低[11]。芽孢桿菌添加到一定量時(shí)，南美白對(duì)蝦的SOD等免疫指標(biāo)比對(duì)照組提高幾倍[12]。

本試驗(yàn)通過(guò)投喂不同劑量的地衣芽孢桿菌飼料發(fā)現(xiàn)：投喂20 d時(shí)，地衣芽孢桿菌能顯著提高鯉魚(yú)SOD、CAT活性（P＜0.05），分別比對(duì)照組提高29.53%、55.5%、47.84%和33.75%、46.25%、62.08%。而對(duì)LZM影響較?。≒＞0.05）；投喂40 d：SOD、CAT、LZM活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），A2組SOD最高，為168.38 U/ml，A3組CAT和LZM活性最高，分別為4.79 U/ml和82.28 U/ml。投喂60 d時(shí)，隨著地衣芽孢桿菌添加量的增加，鯉魚(yú)免疫機(jī)能不同程度顯著提高（P＜0.05）。

本試驗(yàn)中試驗(yàn)組鯉魚(yú)血清生化指標(biāo)的變化，同地衣芽孢桿菌對(duì)三角帆蚌免疫機(jī)能的影響[13]和Harikrishnan等[14]研究芽孢桿菌對(duì)牙鲆免疫機(jī)能影響，以及沈文英等[15]研究飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)免疫功能的影響所報(bào)道的結(jié)果相似，表現(xiàn)為血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均顯著高于對(duì)照組，表明芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)體液免疫因子產(chǎn)生明顯影響，有利于增強(qiáng)鯉魚(yú)抗病力。本試驗(yàn)通過(guò)向飼料中添加地衣芽孢桿菌，顯著增加了血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。說(shuō)明在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的地衣芽孢桿菌能提高鯉魚(yú)的免疫力和抗病力，其中添加0.1%（A2組）就可以最大降低飼料系數(shù)，提高增重率，同時(shí)增加鯉魚(yú)的免疫能力。

對(duì)于地衣芽孢桿菌對(duì)鯉魚(yú)生長(zhǎng)和免疫的影響機(jī)制，需要進(jìn)一步做組織學(xué)和基因組學(xué)研究。