2種HPV檢測方法在宮頸病變診斷中的應(yīng)用研究

張媛媛1， 路玲2， 古扎麗努爾·阿不力孜1， 李華1， 朱明玥1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦外五科， 烏魯木齊830011；2新疆烏魯木齊市婦幼保健醫(yī)院， 烏魯木齊830001)

摘要：目的比較第2代雜交捕獲技術(shù)(HC-2)和低溫PCR檢測法對宮頸病變的診斷應(yīng)用價(jià)值。方法收集2013年4月-2014年4月來新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的232例維吾爾族宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)及慢性宮頸炎患者宮頸分泌物標(biāo)本，分別進(jìn)行HC-2和低溫PCR檢測，低溫PCR技術(shù)檢測不同宮頸病變組織中HPV亞型，HC-2法測定病變組織中HPV DNA含量。分析2種方法檢測結(jié)果的一致性。結(jié)果在232例標(biāo)本中，低溫PCR檢測HPV陽性76例，陽性率為32.76%；HC-2檢測HPV陽性70例，陽性率為30.17%。2種方法檢測結(jié)果一致者210例，一致率為90.51%，Kappa值為0.780；慢性宮頸炎患者HPV亞型以HPV16、HPV56為主；CINⅠ患者HPV亞型以HPV16、HPV18、HPV59為主；CINⅡ患者HPV亞型以HPV16、HPV59為主；CINⅢ患者HPV亞型以HPV16、HPV31為主；宮頸癌患者HPV亞型以HPV16、HPV18、HPV58為主；CINⅠ～Ⅲ以及宮頸癌患者的HPV DNA 含量均高于慢性宮頸炎患者(P<0.01)，宮頸癌患者的HPV DNA含量高于CINⅠ～Ⅲ，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論HC-2和低溫PCR檢測在宮頸嚴(yán)重病變中有較強(qiáng)的一致性，2種檢測方法對宮頸病變的篩查均有較好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：人類乳頭狀瘤病毒； 宮頸癌； 宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變； 聚合酶鏈反應(yīng)

中圖分類號：R737.33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.005

[收稿日期：2014-11-23]

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81272335)； 新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金(XJC201375)

作者簡介：張媛媛(1981-)，女，主治醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤。

The applied research of two types of HPV detection methods in the

diagnosis of cervical lesions

ZHANG Yuanyuan1, LU Ling2, Guzalnur Abliz1, LI Hua1, ZHU Mingyue1

(1DepartmentofGynecologyV,AffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China;2UrumqiCityMaternalandChildHealthHospital,Urumqi830001,China)

Absract： ObjectiveTo compare the diagnostic and applied value of hybrid capture 2 technology (HC-2) and low temperature PCR assay in cervical lesion. MethodsSpecimens of cervical secretions from 232 cases of cervical cancer, cervical intraepithelial neoplasia lesions (CIN) and chronic cervicitis were collected in our hospital. The specimens were detected by HC-2 and low temperature PCR assay and the consistency of the results of two methods was analyzed. ResultsThe HPV positive rate of low temperature PCR detection was 32.76% (76/232) and HPV positive rate of HC-2 was 30.17% (70/232) in specimens of 232 cases. The consistent rate of two methods was 90.51% (210/232) and the Kappa value was 0.780; The main HPV subtypes of chronic cervicitis were HPV16, HPV56, and the main HPV subtypes of CINⅠwere HPV16, HPV18, HPV59, and the main HPV subtypes of CINⅡ were HPV16, HPV59, and the main HPV subtypes of CINⅢ were HPV16, HPV31, while the main HPV subtypes of cervical cancer were HPV16, HPV18, HPV58; The HPV DNA levels of CINⅠ-Ⅲ and cervical cancer were higher than chronic cervicitis (P<0.01), in addition, The HPV DNA levels of cervical cancer were higher than CINⅠ-Ⅲ (P<0.01). ConclusionThe consistency of HC-2 and low temperature PCR detection in cervical severe lesions was strong and the two kinds of detection methods both had strong application value for the screening of cervical lesions.

Key words: human papillomavirus; cervical lesion; PCR assay; hybrid capture 2

宮頸癌是目前唯一的可望被消滅的癌癥，因?yàn)橐汛_定其主要和必要的病因就是人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染[1]。HPV是小分子雙鏈DNA病毒，其基因型達(dá)200多型,根據(jù)HPV與宮頸癌的相關(guān)性分為高危型和低危型,高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌和癌前病變發(fā)生和發(fā)展的必要條件。全世界每年有46.6萬宮頸癌患者，其中80%的宮頸癌患者在發(fā)展中國家，中國約占1/3[2]。新疆宮頸癌的發(fā)病率又高于全國平均水平，死亡率居全國首位，在維吾爾族宮頸癌中HPV陽性率在80%以上，其中HPV16的構(gòu)成比高達(dá)90.0%以上[3]。本研究通過對HPV 2種檢測方法(HC-2 、低溫PCR)的比較，探究2種檢測方法在篩查維吾爾族宮頸癌、宮頸癌癌前期病變(CIN)及慢性宮頸炎中HPV的應(yīng)用價(jià)值，為完善宮頸癌篩查方法提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對象選擇2013年4月-2014年4月來新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的維吾爾族宮頸癌、CIN及慢性宮頸炎患者232例，年齡18～69歲，平均年齡(52.63±8.14)歲。所有病例均未接受放化療，未服激素類藥物，且宮頸癌患者均為南疆地區(qū)長期居住的婦女。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集HC-2標(biāo)本的采集采用液基法，由婦科醫(yī)師采用配套的宮頸采樣器在宮頸口沿同一方向旋轉(zhuǎn)3～5圈，貯存于Digene專用采樣瓶中，用于HC-2檢測。低溫PCR標(biāo)本采用女性專用宮頸刷擦拭宮頸處，采集宮頸分泌物，置入95%酒精中，沿折痕處將宮頸刷折斷放入管中，-20℃保存送檢。

1.2.2HC-2檢測法HC-2法測定病變組織中HPV DNA含量。操作嚴(yán)格按照試劑盒(美國Digene 公司)說明書進(jìn)行，主要步驟有DNA提取、雜交、捕獲、信號放大及信號檢測。陽性結(jié)果的判斷：檢測樣本的相對光單位(RlU)與標(biāo)準(zhǔn)陽性對照的RLU 比值>110。

1.2.3低溫PCR檢測法低溫PCR技術(shù)檢測不同宮頸病變組織中HPV亞型。參照中國科學(xué)院院士洪國藩院士創(chuàng)建的低溫PCR分析技術(shù)。主要步驟：(1)DNA提?。喝? mL樣品，離心5 min；用1 mL三蒸水洗滌沉淀，用1 mL的Buffer溶液洗滌；再次離心5 min；加入100 μL含0.1 mg/mL蛋白酶的Lysis buffer，45℃～55℃保溫過夜；95℃，消化10 min；離心5 min；留取上清，作為PCR檢測的模板。(2) PCR實(shí)驗(yàn)：第1次PCR過程，低溫反應(yīng)體系 20 μL，引物Β11 μL，引物Β21 μL，患者標(biāo)本DNA 1 μL， 水2 μL，總計(jì)25 μL；Β1：5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，Β2：5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′。第2次PCR過程，低溫反應(yīng)體系20 μL，引物GP5 1 μL，引物MY09 1 μL，第1次PCR產(chǎn)物 1 μL，水2 μL，總計(jì)25 μL。以上2次PCR過程變性溫度85℃反應(yīng)2 min，85℃反應(yīng)30 s，40℃反應(yīng)30 s，60℃～65℃反應(yīng)1 min，共30個(gè)周期，最后延伸溫度65℃反應(yīng)10 min。(3)瓊脂糖膠電泳：取5 μL第2次PCR產(chǎn)物與Loading buffer混合，2%的Agarose檢測，陽性產(chǎn)物用于測序。(4) DNA測序，三蒸水13.5 μL，5倍反應(yīng)緩沖液3.5 μL，BigDye1.1 1 μL，測序引物 1 μL，第2次PCR產(chǎn)物 1 μL，在PCR測序儀上進(jìn)行測序反應(yīng)。(5)BLAST：根據(jù)樣品測序所得DNA序列截取約50個(gè)序列較好的堿基在NCBI 網(wǎng)站上Blast，找到完全匹配的HPV類型。

1.2.4陰道鏡及病理學(xué)檢查使用碘染色的方法在陰道鏡下協(xié)助下采集宮頸病變組織，用4%多聚甲醛進(jìn)行標(biāo)本固定，石蠟包埋后切片，厚度為3 μm。由至少2位病理科的副主任以上醫(yī)師在鏡下進(jìn)行病理診斷，結(jié)果為慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌。

2結(jié)果

2.1低溫PCR與HC-2在不同病變組織中一致性結(jié)果在232例標(biāo)本中，慢性宮頸炎44例，CINⅠ50例，CINⅡ66例，CINⅢ34例，宮頸癌38例。低溫PCR檢測HPV陽性76例，陽性率為32.76%；HC-2檢測HPV陽性70例，陽性率為30.17%。2種方法檢測結(jié)果一致者210例，一致率為90.51%，Kappa值為0.780。對不同組織一致性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中，2種方法的一致性最高，Kappa值為0.894，其次在CINⅡ和CINⅢ一致性較好，而在慢性宮頸炎和CINⅠ中2種方法的一致性一般，見表1。

表1　低溫PCR與HC-2在不同病變組織中一致性結(jié)果/例

2.2低溫PCR檢測不同病變組織中HPV亞型分布慢性宮頸炎患者HPV亞型以HPV16(42.86%)、HPV56(28.57%)為主；CINⅠ患者HPV亞型以HPV16(40.00%)、HPV18(20.00%)、HPV59(20.00%)為主；CINⅡ患者HPV亞型以HPV16(43.75%)、HPV59(25.00%)為主；CINⅢ患者HPV亞型以HPV16(58.82%)、HPV31(17.65%)為主；宮頸癌患者HPV亞型以HPV16(58.82%)、HPV18 (15.00%)、HPV58(10.00%)為主，見表2。

2.3HC2檢測不同病變組織中HPV DNA含量的比較CINⅠ～Ⅲ以及宮頸癌患者的HPV DNA 含量均高于慢性宮頸炎患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；宮頸癌患者的HPV DNA含量高于CINⅠ～Ⅲ，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表2　低溫PCR檢測不同病變組織中HPV亞型分布

表3　HC2檢測不同病變組織中HPV DNA 含量的比較( ±s)

注：與慢性宮頸炎比較，aP<0.01； 與CINⅠ比較，bP<0.01； 與CINⅡ比較，cP<0.01； 與CINⅢ比較，dP<0.01。

3討論

新近的研究結(jié)果均證實(shí)HPV感染是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素，而且HPV病毒的型別與載量與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)，尤其是高危型HPV感染患者的風(fēng)險(xiǎn)較大[4]。作為目前唯一獲得美國FDA 認(rèn)證和推薦使用的高危型HPV檢測技術(shù)——HC-2法在宮頸癌早期篩查中的作用已得到大量研究證實(shí)[5]。HC-2是基于核酸雜交的熒光信號放大技術(shù)，具有較高的靈敏度、特異性和重復(fù)性。但該檢測方法只能進(jìn)行高危型和低危型的分類，不能進(jìn)行基因型的分類，且在實(shí)驗(yàn)中還存在高危型探針可與低危型探針發(fā)生交叉反應(yīng)，除可與自身檢測的HPV類型外，還能夠與其他類型的HPV發(fā)生交叉反應(yīng)[6]，并且其成本較高，操作復(fù)雜，耗時(shí)長。

低溫PCR檢測HPV亞型技術(shù)是中國科學(xué)院院士洪國藩院士于2007年創(chuàng)建的低溫PCR分析體系，該體系開發(fā)成為高靈敏度、高精確度的醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)，并成功地用于婦女子宮頸致癌病毒及其他人類病菌的檢測[7]。低溫PCR(聚合酶鏈反應(yīng))是被合適的抗熱DNA聚合酶催化，其獨(dú)特點(diǎn)在于化學(xué)反應(yīng)變性溫度為85℃，取代了傳統(tǒng)的94℃～96℃，研究已發(fā)現(xiàn)這樣可以獲得更準(zhǔn)確、精準(zhǔn)的目標(biāo)DNA的放大擴(kuò)增，甚至超過120個(gè)PCR熱循環(huán)，此外這樣精準(zhǔn)的放大是傳統(tǒng)的PCR無法做到的[8]。該體系還有一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)是PCR樣品不必純化，這樣就避免了樣品純化過程中目的DNA的丟失，且在較低的PCR反應(yīng)溫度條件下，使用兼并引物，可以較大可能地?cái)U(kuò)增出各種HPV，減少了漏診的可能.

本研究采用2種方法檢測HPV感染，結(jié)果顯示，隨著病變的加重，HPV感染率呈上升趨勢，且2種方法的Kappa值也隨之增大，表明2種檢測方法檢測的一致性與宮頸病變的嚴(yán)重程度相關(guān)，也再次證明HPV感染與宮頸病變密切關(guān)聯(lián)，與前期姚軍等[9]的研究結(jié)論是一致的。本研究首次采用低溫PCR檢測了不同病變組織HPV亞型，發(fā)現(xiàn)HPV亞型以HPV16、HPV56為主；CINⅠ患者HPV亞型以HPV16、HPV18、HPV59為主；CINⅡ患者HPV亞型以HPV16、HPV59為主；CINⅢ患者HPV亞型以HPV16、HPV31為主；宮頸癌患者HPV亞型以HPV16、HPV18、HPV58為主，體現(xiàn)了維吾爾族與其他地區(qū)人群存在差異，也體現(xiàn)了不同的HPV亞型的致病性不同，隨著宮頸病變的加重，高危型HPV的感染率增高[10]。本研究采用HC-2技術(shù)檢測標(biāo)本，結(jié)果顯示宮頸癌和CINⅠ～Ⅲ患者的HPV DNA含量明顯高于慢性宮頸炎，且宮頸癌患者的HPV DNA含量高于CINⅠ～Ⅲ，這說明宮頸癌HPV DNA含量與宮頸的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，較高的HPV DNA含量可能會(huì)促進(jìn)慢性宮頸炎患者逐步發(fā)展到CIN，甚至宮頸癌。

綜上所述，HC-2和低溫PCR檢測在宮頸嚴(yán)重病變中有較強(qiáng)的一致性，低溫PCR技術(shù)可對不同宮頸病變組織中HPV亞型進(jìn)行檢測，而HC-2可測定病變組織中的HPV DNA含量，2種檢測方法對宮頸病變的篩查均有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

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(本文編輯王艷)

通信作者：古扎麗努爾·阿不力孜，女(維吾爾族)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：宮頸癌病因及干預(yù)研究，E-mail:gzlnr@qq.com。