紫丹銀屑顆粒對銀屑病模型小鼠的HaCaT細胞周期和血清IL－2、TNF－α的影響

紫丹銀屑顆粒對銀屑病模型小鼠的HaCaT細胞周期和血清IL-2、TNF-α的影響

李偉妮1，李忠原1,崔文2，王平3，孫虎3，李百開1

(1.煙臺東誠大洋制藥有限公司，山東 煙臺 265500；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003；

3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014)

摘要：目的探討紫丹銀屑顆粒對銀屑病樣小鼠模型的治療作用和作用機制，為臨床應(yīng)用提供參考。方法將試驗動物隨機分為正常對照組、模型對照組、紫丹銀屑高、中、低劑量組及陽性對照組，每組10只，灌胃給藥。采用流式細胞分析儀分析紫丹銀屑顆粒對HaCaT細胞周期的影響(在96孔板上依次設(shè)定紫丹銀屑顆粒2、4、8、16、32 g·L-1組，維A酸片8 g·L-1組，空白細胞組)；采用動物體內(nèi)實驗，觀察紫丹銀屑顆粒對銀屑病小鼠模型血清中白介素-2、腫瘤壞死因子含量的影響。結(jié)果體外試驗顯示，與模型組比較，紫丹銀屑顆粒高、中劑量組細胞增殖數(shù)量顯著減少，有顯著性差異(P<0.05)；體內(nèi)試驗顯示，與模型組比較，紫丹銀屑顆粒高、中劑量組S期細胞數(shù)量顯著減少，有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論紫丹銀屑顆粒能夠顯著抑制人永生化表皮細胞增殖，并顯著降低模型動物血清白介素-2、腫瘤壞死因子的含量，這可能是紫丹銀屑顆粒治療銀屑病的作用機制之一。

關(guān)鍵詞：紫丹銀屑顆粒；HaCaT細胞；白介素-2；腫瘤壞死因子；小鼠

作者簡介：李偉妮，女，研究方向：中藥學(xué)，E-mail:liweini@163.com

通訊作者：王平，女，副研究員，研究方向：中藥藥理，Tel:0531-82949812,E-mail:wangpingjinan@163.com

中圖分類號：R965文獻標識碼：A

Effect on the HaCaT cell generation cycle and serum IL-2，TNF-α of

psoriasis sample model mice treating by Zidanyinxie Particle

LIWei-ni1，LIZhong-yuan1,CUIWen2，WANGPing3,SUNHu3，LIBai-kai1

(1.YantaiDongchengDayangPharmaceuticalCo.,Ltd.,Yantai265500，China；2.TheAffiliated

HospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003，China；3.DepartmentofPharmacology,

ShandongAcademyofChineseMedicine，Jinan250014，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Zidanyinxie Particle for mice psoriasis sample.MethodsAll the mice were randomly divided into normal control group,model group,Zidanyinxie Particle high dosage group,Zidanyinxie Particle middle dosage group，Zidanyinxie Particle small dosage group,and positive control group,each group had 10 mice，gavaged.Prepared serum containing drug,concentration was Zidanyinxei Particle 2,4,8,16,32 g·L-1,Tretinoin Tablets 8 g·L-1.In vitro test，to detect the effect of Zidanyinxie Particle in HaCaT cell generation cycle;In vivo test,after giving relevant drugs，to observe serum IL-2 and TNF-α of vaginal epithelial pathological model mice.ResultsIn vitro experiments,compared with model control group，cell proliferation was significantly reduce in the Zidanyinxie Particle high dosage group,Zidanyinxie Particle middle dosage group,P<0.05.In vivo studies,compared with normal control group，the number of mitotic vaginal epithelial cells were significantly increased in model group,P<0.05,and compared with model control group，the number of mitotic vaginal epithelial cells were significantly decreased in Zidanyinxie Particle high dosage group,Zidanyinxie Particle middle dosage group,P<0.05.ConclusionZidanyinxie Particle could inhibited the proliferation of HaCaT cell and reduced the Serum IL-2,TNF-α content of mice model significantly，this may be one of the mechanisms of Zidanyinxie Particle in treating psoriasis.

Key words:Zidanyinxie Particle;HaCaT cell;IL-2;TNF-α;Mice

銀屑病是一種皮膚科常見的易反復(fù)發(fā)作的疾病，被世界衛(wèi)生組織定為十大頑疾之一。臨床表現(xiàn)為周身或者局部皮膚白色鱗屑，病理學(xué)表現(xiàn)為表皮細胞過度增殖及異常分化，炎癥細胞浸潤，真皮血管增生[1，2]。銀屑病根治困難，容易復(fù)發(fā)，病程遷延日久，肌膚失養(yǎng)，摧殘身體，給患者帶來極大的心理和生理負擔(dān)，臨床迫切需要開發(fā)相應(yīng)的治療藥物。紫丹銀屑顆粒，是根據(jù)臨床經(jīng)驗方開發(fā)的新藥，用于治療血虛風(fēng)燥所致的銀屑病。通過體外細胞試驗和體內(nèi)動物試驗對其作用機理進行了探討，分析紫丹銀屑顆粒對人永生化表皮細胞(HaCaT細胞)周期的影響，觀察紫丹銀屑顆粒對銀屑病小鼠模型血清中白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNF-α)含量的影響。

1試驗材料

1.1試驗動物ICR小鼠，SPF級，110只，雌性，體重18～22 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所，動物許可證號：SCXK(京)2009-0007。

1.2試驗藥物紫丹銀屑顆粒(生產(chǎn)批號：110602，煙臺東誠大洋制藥公司)；維A酸片(生產(chǎn)批號：H10970054，山東良福制藥有限公司)；秋水仙堿(生產(chǎn)批號：111103，西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司)；己烯雌酚(生產(chǎn)批號：100318，天津金耀氨基酸有限公司)。

1.3試驗試劑HaCaT細胞(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞資源中心)；IL-2試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)； TNF-α試劑盒(上海富眾生物科技發(fā)展有限公司)；胎牛血清(美國GLBCO公司)；細胞周期及凋亡檢測試劑盒(RNase+PI，南京凱基生物科技公司)；RPM1640培養(yǎng)基(美國GLBCO公司)。

1.4試驗儀器超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備儀器廠)；HF151UVCO2培養(yǎng)箱(上海力新實業(yè)有限公司)； BIO-RAD680酶標儀(美國BIO-RAO公司)；TDL-5臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海驚宏實驗設(shè)備有限公司)；FAC scalibur流式細胞分析儀及軟件(美國B&D公司)。

2試驗方法

2.1體外試驗

2.1.1HaCaT細胞培養(yǎng)HaCaT細胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，選對數(shù)生長期細胞進行試驗。

2.1.2紫丹銀屑顆粒含藥血清的制備取50只雌性小鼠，隨機分為5組，每組10只，分別為正常對照組、紫丹銀屑顆粒低、中、高劑量組、維A酸片組。參考《藥理實驗方法學(xué)》[3]中人與小鼠之間的劑量換算方式，折算小鼠的給藥量，分別設(shè)置紫丹銀屑顆粒高劑量組(2.16 g·kg-1)、紫丹銀屑顆粒中劑量組(1.08 g·kg-1)、紫丹銀屑顆粒低劑量組(0.54 g·kg-1)，維A酸片組(2.70 g·kg-1)，正常對照組給予等體積的蒸餾水。連續(xù)灌胃給藥5 d，每日1次。末次給藥0.5 h后，摘眼球取血，棄去第1滴血液。血液靜置1 h，3 000 rpm，離心5～10 min，取血清，56 ℃、30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜除菌分裝，稀釋成10%濃度的含藥血清。

2.1.3紫丹銀屑顆粒對HaCaT細胞周期的影響將對數(shù)生長期的HaCaT細胞按照每毫升2×105的濃度接種于96孔板上，依次設(shè)定為紫丹銀屑顆粒2、4、8、16、32 g·L-1組，空白細胞組，維A酸片8 g·L-1組，每組3個復(fù)孔。藥物干預(yù)48 h后，消化貼壁生長的HaCaT細胞收集于EP管中，用預(yù)冷的PBS吹勻，再以2 000 rpm，離心15 min，棄去上清液，加入4 ℃預(yù)冷75%乙醇3 mL，固定30 min后再次離心，重懸，用流式細胞儀測定細胞周期。試驗結(jié)果進行組間統(tǒng)計分析。

2.2體內(nèi)試驗

2.2.1建立銀屑病動物模型將60只雌性小鼠，隨機分為6組，分別為正常對照組、模型對照組、紫丹銀屑顆粒高劑量組(2.16 g·kg-1)、紫丹銀屑顆粒中劑量組(1.08 g·kg-1)、紫丹銀屑顆粒低劑量組(0.54 g·kg-1)，維A酸片組(2.70 g·kg-1)，每組10只。除正常對照組以外小鼠均腹腔注射己烯雌酚，每次0.2 mg，每天1次，連續(xù)3 d。

2.2.2紫丹銀屑顆粒對銀屑病動物模型血清IL-2、TNF-α的影響從造模第4天開始，各給藥組分別給予相對應(yīng)的藥液，正常對照組與模型對照組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥5 d。于試驗第9天灌胃后2 h后各組小鼠腹腔注射秋水仙堿2 mg·kg-1，使有絲分裂停止于中期。4 h后各組小鼠摘眼球取血，離心后，取血清，分別檢測血清IL-2、TNF-α的數(shù)值，試驗結(jié)果進行組間統(tǒng)計分析。

3試驗結(jié)果

3.1體外試驗中各組HaCaT細胞周期比較 試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞的各個周期發(fā)生了改變。與模型組比較，紫丹銀屑顆粒高、中劑量組S期細胞數(shù)量顯著減少，有顯著性差異(P<0.05)；與維A酸組的細胞數(shù)量接近，P>0.05，結(jié)果見表1。

表1　各組小鼠HaCaT細胞周期比較

注：與正常對照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

3.2各組血清中IL-2、TNF-α含量結(jié)果試驗結(jié)果顯示，與模型對照組相比，紫丹銀屑顆粒高、中、低劑量組均能夠顯著降低造模大鼠血液中IL-2、TNF-α的含量，其中高劑量試驗結(jié)果有非常顯著性差異(P<0.01)，中劑量試驗結(jié)果有顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2　紫丹銀屑顆粒對小鼠血清IL-2、TNF-α的含量

注：與正常對照組比較，＊P<0.05；與模型對照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4討論

銀屑病是一種由于多種因素參與的慢性免疫性皮膚病，其致病機理復(fù)雜，發(fā)病率高。主要的病理改變?yōu)榻琴|(zhì)增厚，角化不全，表現(xiàn)為皮膚銀白色鱗屑，屬于中醫(yī)“白疕”范疇[4，5]。中醫(yī)學(xué)認為銀屑病的病因病機為血熱內(nèi)蘊、陰血耗傷，生風(fēng)致燥，肌膚失養(yǎng)，則起白屑。即本病病因在血，病位在肌表。在長期的治療過程中，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者大都畏寒喜熱，同時伴有口干舌燥，心煩易怒等，故認為銀屑病久病出現(xiàn)陽虛寒凝，陰血耗傷，氣滯血瘀，使皮膚失于濡養(yǎng)而發(fā)病[6，7]。 紫丹銀屑顆粒，由紫硇砂、決明子、附子(制)、干姜、桂枝、白術(shù)、白芍、黃芪、丹參、降香等10味中藥組成，具有溫養(yǎng)活血、養(yǎng)血祛風(fēng)、潤燥止癢的功效[8]，臨床治療銀屑病療效確切。體外試驗結(jié)果顯示，紫丹銀屑顆粒具有顯著抑制HaCaT細胞過度增殖， 促使細胞的自然生長平衡，最終維持表皮層的穩(wěn)定。同時，紫丹銀屑顆粒能夠降低小鼠血清IL-2、TNF-α含量的含量，從而減輕銀屑病發(fā)病后的炎癥反應(yīng)。本研究為臨床合理用藥提供了參考。

參考文獻：

[1]鄭明警，馬麗俐.大青葉等清熱藥對HaCaT細胞增殖的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，23(4)：262.

[2]韓玲.銀屑病藥效學(xué)動物模型及其在中藥新藥研究中應(yīng)用的思考[J].中藥藥理與臨床，2006，22(6)：73-75.

[3]徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1982.

[4]鹿見香,李锘,樸珉貞,等.祛銀顆粒對角質(zhì)形成細胞生長因子誘導(dǎo)的HaCaT細胞增殖及分泌TNF-α的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2014，23(6)：1025-1028.

[5]康爾恂，李新宇，鄭家潤.角質(zhì)形成細胞生長因子對HaCaT細胞增殖的影響[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2006，22(2)：108-110.

[6]封紹奎，雷鵬程，萬俊增.皮膚性病學(xué)[M].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2000.

[7]常立新，劉小雷,張銘杰,等.百應(yīng)膠囊治療銀屑病的實驗性藥效學(xué)研究[J].中國藥物與臨床，2009,9(4):327.

[8]陶萍,聶洪邵,徐晴嬌,等.紫丹銀屑顆粒治療銀屑病的臨床觀察[J].齊魯藥事，2010,29(6)：372-373.