百里香酚與苯醚甲環(huán)唑?qū)γ⒐俑【穆?lián)合毒力

葉火春+周穎+張靜+閆超+馮崗

摘 要 為明確百里香酚與苯醚甲環(huán)唑混配藥劑對芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat.）的毒力增效作用，采用菌絲生長速率法測定百里香酚、苯醚甲環(huán)唑及其混配藥劑對芒果蒂腐病菌的毒力，結(jié)合Horsfall法篩選混配藥劑的增效比例，以孫云沛共毒系數(shù)法評價其聯(lián)合毒力。結(jié)果顯示，百里香酚與苯醚甲環(huán)唑配比為8∶2、7∶3和6∶4時，對抑制芒果蒂腐病菌菌絲生長表現(xiàn)為增效作用，其中以7∶3時增效最明顯，毒性比率TR值為1.26；共毒系數(shù)法顯示，百里香酚與苯醚甲環(huán)唑以7∶3混配時的EC50值為16.53 μg/mL，CTC值達175.25，增效顯著。百里香酚與苯醚甲環(huán)唑混劑抑制芒果蒂腐病菌菌絲生長的最佳增效配比為7∶3。

關鍵詞 百里香酚 ；苯醚甲環(huán)唑 ；可可球二孢菌 ；混配 ；增效作用

分類號 S482.2

Synergistic Toxicity of Thymol and Difenoconazole on Mango Pathogenic

Fungi Botryodiplodia theobroma

YE Huochun ZHOU Ying ZHANG Jing YAN Chao FENG Gang

（1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101；

2 Heilongjiang Bayi Agriculture University， Daqing， Helongjiang 163319）

Abstract The aim of this study was to investigate the synergistic effect of thymol and difenoconazole mixed fungicides on Botryodiplodia theobroma Pat； The toxicity to B. theobroma Pat of thymol， difenoconazole and their mixture was determined by mycelium growth rate test； Horsfall test design and Sun-Johnson method were used to evaluate the synergistic effect of the fungicides against B. theobroma Pat. The result showed that the mixtures of thymol and difenoconazole at the ratio of 8∶2， 7∶3 and 6∶4 exhibited synergistic internation against the mycelial growth of B. theobroma Pat， and the most obvios synergistic effect at the ratio of 7∶3 with toxicity ratio（TR）of 1.26.The result of sun-Johson showed that the EC50 value of the 7∶3 mixture was 16.53 μg/mL， and the mixture indicate evident synergistic effect with CTC value of 175.25. The mixture of thymol and difenoconazole at the ratio of 7∶3 is the optimal synergistic proportion.

Keywords thymol ； difenoconazole ； Botryodiplodia theobroma Pat. ； mixture ； synergistic effect.

近年來，以苯醚甲環(huán)唑防控芒果蒂腐病取得良好的效果，然而由于作用靶標位點單一，也將面臨病菌抗藥性產(chǎn)生的風險，為了減緩苯醚甲環(huán)唑抗藥性，利用藥劑合理混配，實施藥劑多作用位點防治是延緩藥劑抗藥性有效途徑之一。百里香酚自2013年被批準作為植物保護產(chǎn)品后，備受人們關注[1]。本研究嘗試將其與苯醚甲環(huán)唑混配，旨在為開發(fā)基于百里香酚的新型防治芒果蒂腐病的速效混劑以及植物病原菌對苯醚甲環(huán)唑抗藥性治理提供依據(jù)。

芒果蒂腐病是一種普遍發(fā)生且危害嚴重的世界性芒果病害，該病于幼果期潛伏侵染，于芒果后熟期發(fā)病，迅速造成果肉變軟腐爛，病果率達10%～40%[2]。研究表明，海南芒果蒂腐病主要由可可球二孢菌（Botryodiplodia theobroma Pat.）引起，該病菌還可為害木瓜、可可、木薯等多種作物和林木，以為害果實和莖部為主，還可侵染葉部和根部[3-4]。化學防治是控制該病害的主要方法，然而頻繁單一地使用化學殺菌劑容易導致病原菌抗藥性的產(chǎn)生，如該病原菌對多菌靈、苯萊特、甲基硫菌靈、烯唑醇和嘧菌酯均表現(xiàn)出抗藥性，造成防治效果降低和藥劑的大量使用[5]。

苯醚甲環(huán)唑是一種廣譜、高效、低毒的三唑類殺菌劑，廣泛應用于果樹、蔬菜等作物，有效防治葉斑病、黑星病、白粉病、銹病等多種作物病害[6]。近年來，該藥已常用于防治芒果采前、采后病害[7]。苯醚甲環(huán)唑?qū)夔薮济摷谆种苿―MI），作用位點單一，長期頻繁使用，抗藥性風險不容忽視[8]。苯醚甲環(huán)唑相比其他三唑類殺菌劑抗性水平較低，但最近幾年陸續(xù)報道了該藥在蘋果腐爛病、黑星病及小麥赤霉病上出現(xiàn)抗藥性，并呈上升趨勢[8-11]。芒果蒂腐病菌目前尚未對苯醚甲環(huán)唑出現(xiàn)抗藥性，但該病菌已對多種高效、選擇性的殺菌劑表現(xiàn)出了抗藥性。為減緩芒果蒂腐病菌抗藥性產(chǎn)生、延長有效期和提高藥效，苯醚甲環(huán)唑與不同作用機制的殺菌劑混合使用有必要進行。有研究報道，苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯混配對馬鈴薯早疫病、花生褐斑病及山藥炭疽病的防治均有增效作用，與咯菌腈混配對防治馬鈴薯早疫病也表現(xiàn)了增效作用，并提高產(chǎn)量[6，12-14]。

百里香酚（Thymol，5-甲基-2-異丙基酚）又名麝香草酚，為百里香等唇形科植物精油的主要成分之一，具有驅(qū)蟲，抗氧化和抗菌活性。近年研究表明，百里香酚對芒果蒂腐病等多種植物病原菌具有良好的抗菌活性[15-16]，可通過抑制端粒酶或者ATPase活性而抑制真菌生長[17-18]。

目前百里香酚作為殺菌劑的商品制劑還很罕見，如何利用好其作為植保產(chǎn)品，成為人們關切的問題。同時國內(nèi)尚未報道預防芒果蒂腐病菌對苯醚甲環(huán)唑抗藥性產(chǎn)生的混劑，因此本研究嘗試將百里香酚與苯醚甲環(huán)唑混配，以期獲得百里香酚與苯醚甲環(huán)唑增效混配配方。為明確百里香酚與苯醚甲環(huán)唑混劑是否對芒果蒂腐病菌增效，本研究測定了百里香酚與苯醚甲環(huán)唑混劑對芒果蒂腐病菌聯(lián)合毒力以及增效系數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

芒果蒂腐病菌（可可球二孢菌）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所采后病理及保鮮實驗室提供，斜面培養(yǎng)并保存，轉(zhuǎn)接至平板培養(yǎng)2 d備用。

1.1.2 藥劑

百里香酚（≥99.0%）購自國藥集團化學試劑有限公司，95%苯醚甲環(huán)唑原藥購自山東濰坊瑞豐化工有限公司，上述兩種藥劑分別用丙酮配制為5.00×104 mg/L和1.00×104 mg/L的母液備用。

1.2 方法

1.2.1 百里香酚和苯醚甲環(huán)唑單劑對芒果蒂腐病菌的毒力測定

毒力測定采用菌絲生長速率法[19]。在預試的基礎上，將百里香酚母液用0.1%吐溫-80無菌水溶液配制成200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 mg/L的含藥PDA平板，苯醚甲環(huán)唑母液用0.1%吐溫-80無菌水溶液配制成0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 2 mg/L的PDA平板，在芒果蒂腐病菌培養(yǎng)2 d的菌落邊緣制取菌塊（直徑為0.40 cm），置于含藥平板中央，于28℃培養(yǎng)，每個處理重復3次，以不加藥劑的平板為對照。測量處理后菌落直徑，并計算抑制率及抑制中濃度EC50。

1.2.2 百里香酚和苯醚甲環(huán)唑混配最佳比例篩選

采用Horsfall[20]法設計混配比例，生物測定同1.2.1。將百里香酚與苯醚甲環(huán)唑兩單劑分別以0.1%吐溫-80無菌水溶液配制EC50藥液，以其體積比為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 、9∶1、0∶10設置11種比例混配處理，以不加藥劑的處理為對照，重復3次，計算各混配藥劑的抑制率及毒性比率TR（實際抑制率/理論抑制率）。當TR值大于1為增效作用；等于1左右為相加作用；若小于1為拮抗作用，以TR最高者為最佳配比。

1.2.3 混配藥劑共毒系數(shù)測定

在確定最佳配比的基礎上，設置5個濃度梯度，重復3次，以不加藥劑為空白對照，生物活性測定同1.2.1，計算混配藥劑的EC50。根據(jù)上述測定基礎，采用孫云沛法計算混配藥劑共毒系數(shù)（CTC），以CTC值大小評價混配藥劑的增效作用。若CTC值大于120，為增效作用；若在80～100之間為相加作用；而明顯小于100（80以下）時，則為拮抗作用[21]。

公式中A、B藥劑為混配的單劑， A%和B%分別為A、B單劑在混合藥劑中的含量；標準藥劑以其中一種單劑進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香酚與苯醚甲環(huán)唑毒力測定

百里香酚與苯醚甲環(huán)唑?qū)γ⒐俑【玖Y(jié)果表明，兩種單劑均有較高毒力，而苯醚甲環(huán)唑毒力明顯高于百里香酚，二者EC50值分別為0.14和29.03 μg/mL，見表1。

2.2 混配殺菌劑毒性比率測定

百里香酚和苯醚甲環(huán)唑分別配制成30.0和0.150 μg/mL兩種單劑藥液，按其體積比混配的活性結(jié)果表明，兩者以8∶2、7∶3和6∶4等3種配比的毒性比率大于1，呈現(xiàn)增效作用，其中以配比為7：3的毒性比率最高，達到了1.26，其增效作用最明顯；其他配比均不超過1，未表現(xiàn)出增效作用，如表2。

2.3 混配殺菌劑共毒系數(shù)測定

百里香酚與苯醚甲環(huán)唑在配比7∶3時，對芒果蒂腐病菌的EC50值為16.53 μg/mL，毒力回歸方程為Y=2.476 3+2.071 6X，共毒系數(shù)為175.25，CTC值大于120，表現(xiàn)為增效作用（圖1），結(jié)果與Horsfall法測定相符。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

百里香酚與苯醚甲環(huán)唑?qū)γ⒐俑【L均具有良好抑制活性，二者按EC50值劑量混配的最佳增效配比為7∶3，該配比混合的聯(lián)合毒力EC50值為16.53 μg/mL，共毒系數(shù)達175.25，增效顯著。

3.2 討論

本試驗藥劑混配采用Horsfall法和孫云沛共毒系數(shù)法先后進行定性和定量篩選，具有覆蓋面寬、成功率高和減少工作量等優(yōu)點，該篩選方法是一種較佳室內(nèi)試驗設計方案[20]，倍受科研人員青睞。葉正和等[22]采用該篩選方法在草莓白粉病殺菌劑混配測定時取得良好篩選結(jié)果，張胡煥等[23]在該方法基礎上篩選了防治芒果炭疽病菌增效藥劑配方。

植物源活性物質(zhì)與化學農(nóng)藥增效混配，提高了植物源活性物質(zhì)的防治效果，延緩化學農(nóng)藥抗性產(chǎn)生、減少農(nóng)藥用量，提高對環(huán)境安全性，減少農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量問題。植物源活性物質(zhì)與化學農(nóng)藥合理混配，擴展了植物源物質(zhì)農(nóng)藥活性的應用空間，同時也延長了化學農(nóng)藥的使用年限。植物源茶皂素與代森錳鋅混配配比為3∶7時對辣椒炭疽病菌防效優(yōu)于這兩種單劑[24]，乙蒜素與壬菌銅按一定配比混配提高了對番茄灰霉病的防效[25]，小檗堿加入微量多菌靈即可增強其對桃褐腐病的抑制活性[26]。本研究表明，百里香酚與苯醚甲環(huán)唑以配比為7∶3時，對芒果蒂腐病菌具有一定的增效作用，這結(jié)果為百里香酚和苯醚甲環(huán)唑混配制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。本研究只在室內(nèi)篩選藥劑增效混配組合，其田間藥效，作用方式及增效機理等還亟待一步研究。

百里香酚存在于多種植物精油中，提取工藝簡易，其化學結(jié)構(gòu)也不復雜，易于合成，這就為百里香酚原藥的大規(guī)模生產(chǎn)創(chuàng)造了有利的條件[15]。因此，百里香酚來源豐富，具有廣闊的綜合利用開發(fā)前景。源于植物產(chǎn)物的百里香酚在自然界中易降解，對環(huán)境安全，尋找與其混配具有互作增效的殺菌劑，并結(jié)合相應的合理組合、室內(nèi)生物測定與田間試驗等方法，篩選出安全、經(jīng)濟和高效的百里香酚殺菌制劑，從而拓展百里香酚做為植物保護產(chǎn)品的應用范圍，同時提高化學殺菌劑使用壽命，因此開展百里香酚及其混劑的商品化制劑研究具有重要意義。

參考文獻

[1] 歐盟批準百里香酚用作植保產(chǎn)品[J]. 農(nóng)藥，2013，52（07）：518.

[2] 王璧生，劉朝禎，戚佩坤. 芒果蒂腐病病原菌的鑒定及采后藥劑試驗[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報， 1994，15（03）：55-60.

[3] 鄧澤明，胡美姣，白菊仙，等. 海南省杧果蒂腐病病原菌的初步研究[J]. 中國南方果樹，2002，31（04）：39-41.

[4] 李 敏，胡美姣，岳建軍，等. 芒果可可球二孢蒂腐病菌生物學培養(yǎng)特性[J]. 熱帶作物學報，2009，30（11）：1 660-1 664.

[5] 胡美姣，師 超，安 勇，等. 杧果蒂腐病菌對多菌靈的抗藥性測定及其殺菌劑篩選[J]. 果樹學報，2009，26（05）：671-677.

[6] 何獻聲. 吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑混劑對花生褐斑病的防治[J]. 農(nóng)藥，2014，53（09）：677-679.

[7] 潘曉威，楊 葉，張 宇，等. 苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ珊竺⒐谋ｕr研究[J]. 農(nóng)藥學學報，2014，16（02）：138-143.

[8] Pfeufer E E， Ngugi H K. Orchard factors associated with resistance and cross resistance to sterol demethylation inhibitor fungicides in populations of Venturia inaequalis from Pennsylvania[J]. Phytopathology， 2012， 102（3）： 272-282.

[9] 索朗拉姆. 蘋果樹腐爛病菌對苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯的敏感性研究[D]. 西安：西北農(nóng)林科技大學，2010.

[10] Rekanovic E， Mihajlovic M， Potocnik I. In vitro Sensitivity of Fusarium graminearum （Schwabe） to Difenoconazole， Prothioconazole and Thiophanate-Methyl[J]. Pesticides and Phytomedicine， 2010， 25（4）： 325-333.

[11] Mondino P， Casanova L， Celio A， et al. Sensitivity of Venturia inaequalis to Trifloxystrobin and Difenoconazole in Uruguay[J]. Journal of Phytopathology， 2015， 163（1）： 1-10.

[12] 張 帥，李世雄，楊太新，等. 苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯混合物對炭疽病菌的聯(lián)合毒力及藥效[J]. 植物保護，2013，39（06）：160-163.

[13] 范子耀，王文橋，孟潤杰，等. 吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑混合物對茄鏈格孢的聯(lián)合毒力及其對馬鈴薯產(chǎn)量的影響[J]. 農(nóng)藥學學報，2011，13（06）：591-596.

[14] 范子耀，孟潤杰，馬志強，等. 咯菌腈與苯醚甲環(huán)唑等三種藥劑復配對馬鈴薯早疫病菌（Alternaria solani）的聯(lián)合毒力[J]. 植物保護， 2012， 38（5）： 184-188.

[15] 張 靜，馮 崗，袁旭超，等. 百里香酚抑菌活性初探[J]. 中國農(nóng)學通報， 2009， 25（21）： 277-280.

[16] Numpaque M A， Oviedo L A， Gil J H， et al. Thymol and carvacrol： biotransformation and antifungal activity against the plant pathogenic fungi Colletotrichum acutatum and Botryodiplodia theobromae[J]. Tropical Plant Pathology， 2011， 36（1）： 3-13.

[17] Ahmad A， Khan A， Yousuf S， et al. Proton translocating ATPase mediated fungicidal activity of eugenol and thymol[J]. Fitoterapia， 2010， 81（8）： 1157-1162.

[18] Darvishi E， Omidi M， Bushehri A A.， et al. Thymol antifungal mode of action involves telomerase inhibition[J]. Medical Mycology， 2013， 51（8）： 826-834.

[19] 沈晉良. 農(nóng)藥生物測定[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2013：83-86.

[20] 陳福良，鄭斐能，王 儀. 農(nóng)藥混配室內(nèi)毒力測定的一種實驗技術[J]. 農(nóng)藥科學與管理，1997（04）：30-31.

[21] 胡偉群，朱衛(wèi)剛，張蕊蕊，等. 噻唑鋅與嘧菌酯對黃瓜霜霉病的混配增效作用[J]. 農(nóng)藥，2012，51（01）：73-74.

[22] 葉正和，蘇賢巖，任學祥，等. 氯啶菌酯與多菌靈混配對草莓白粉病的增效作用及田間效果測定[J]. 農(nóng)藥，2013，52（06）：447-448.

[23] 張胡煥，謝藝賢，蒲金基，等. 常用殺菌劑及其混劑對芒果炭疽病菌的毒力測定[J]. 農(nóng)藥，2010（01）： 64-65.

[24] 郝衛(wèi)寧，陳文團，胡美英，等. 茶皂素與代森錳鋅對辣椒炭疽病菌的聯(lián)合毒力[J]. 中國蔬菜，2010，（10）： 68-71.

[25] 周艷麗. 壬菌銅與乙蒜素增效復配制劑研究[D]. 西北農(nóng)林科技大學，2014.

[26] 符偉輝，葛喜珍，田平芳. 小檗堿和多菌靈復配對桃褐腐病菌的抑制效果[J]. 北京化工大學學報（自然科學版），2013，40（01）：89-92.