劉淑雅 俞志明 宋秀賢 曹西華

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

有害藻華在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā), 破壞生態(tài)平衡, 造成魚類、貝類或鳥類大量死亡, 甚至危害人類健康(Sellner et al, 2003), 已經(jīng)成為嚴(yán)重的海洋災(zāi)害,其預(yù)防及治理受到廣泛關(guān)注。粘土礦物絮凝法因來源豐富、成本較低和沒有二次污染, 被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的藻華治理方法之一(Anderson, 1997)。但由于粘土礦物溶膠性差, 自身絮凝速度太快導(dǎo)致去除有害微藻效率較低, 在實(shí)際應(yīng)用中需要大量噴灑, 存在淤渣大量沉積的問題(俞志明等, 1993)。為了提高絮凝效率, 俞志明等(1994, 1995a, b)提出了粘土改性方法, 通過增加粘土顆粒與微藻細(xì)胞間的靜電吸引作用及在粘土顆粒與生物之間形成“橋聯(lián)作用”, 顯著增強(qiáng)了粘土的除藻能力, 得到了廣泛地推廣與應(yīng)用。在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用中發(fā)現(xiàn), 改性粘土不僅能夠絮凝沉降大量的藻華生物, 而且殘余部分微藻也未能在短時(shí)間內(nèi)增殖、再次形成藻華, 說明改性粘土對(duì)未被絮凝的微藻也有抑制作用, 但其作用機(jī)制尚不清楚。

微藻生理生化性質(zhì)的變化可以表征不同環(huán)境變化對(duì)細(xì)胞的影響。例如, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)是藻細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的正常產(chǎn)物, 通常情況下它的產(chǎn)生與消除在細(xì)胞復(fù)雜的調(diào)控下處于動(dòng)態(tài)平衡中。但逆境脅迫將導(dǎo)致細(xì)胞積累過多的 ROS,可使膜脂過氧化、蛋白質(zhì)損傷、DNA鏈斷裂(蔡以瀅等, 1999)。ROS也可作為信號(hào)傳遞分子(Dat et al,2000), 激發(fā)細(xì)胞的防御系統(tǒng), 其中抗氧化酶是細(xì)胞抵御過氧化傷害的重要防御體系?？寡趸赶到y(tǒng)是微藻在環(huán)境脅迫下一個(gè)重要的生理生化指標(biāo), 對(duì)細(xì)胞消除ROS具有重要作用。有研究表明, 紫外輻射(Leeet al, 2009)、強(qiáng)光(卿人韋等, 2003)、病原體(蔡以瀅等,1999)、化學(xué)物質(zhì)(Mei et al, 2014; Martins et al, 2015)及重金屬(Pinto et al, 2003)等逆境脅迫因子能夠激發(fā)海洋微藻的抗氧化酶防御系統(tǒng), 甚至損害該系統(tǒng)?？寡趸富钚缘奶岣哂兄谇宄?xì)胞內(nèi)積累的自由基,從而使細(xì)胞在一定程度上忍耐逆境脅迫, 因此可以用來指示微藻細(xì)胞損傷的程度。本文以小球藻(Chlorella vulgaris)為模式藻(Huang et al, 2009; Wang et al, 2010), 研究改性粘土絮凝法對(duì)其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)等抗氧化酶活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響, 從生理生化角度探討改性粘土方法對(duì)殘留微藻的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用藻種為小球藻(Chlorella vulgaris),由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(藻種編號(hào)： HN-CX), 分離自海南海域。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)海水取自青島膠州灣海域, 經(jīng) 0.45μm混合纖維膜過濾后121°C高溫滅菌30min。采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定微藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況, 選取指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所使用的粘土為江蘇吳縣高嶺土, 其理化參數(shù)見 Liu等人(2016)的報(bào)道, 所使用的改性劑為無機(jī)改性劑聚合氯化鋁(poly aluminum chloride, PAC),改性粘土的制備方法參照相關(guān)文獻(xiàn)(俞志明等, 1994)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將小球藻于(20±1)°C, L1培養(yǎng)液(每1L過濾滅菌海水中加入 1mL 75g/L NaNO3; 1mL 5g/L NaH2PO4·H2O; 1mL的L1微量金屬元素和0.5mL的維他命)中培養(yǎng), 光照強(qiáng)度為 72μmol photons/(m2·s),光暗比12h∶12h。小球藻呈現(xiàn)自然指數(shù)增長(zhǎng)狀態(tài), 在第 10天達(dá)到(10.00±0.07)×106cell/mL, 將藻液轉(zhuǎn)移至6個(gè)5L三角瓶中培養(yǎng), 分為三組： 改性粘土組、原土組(未改性粘土)和對(duì)照組, 每組 2個(gè)平行樣。為了研究改性粘土絮凝法對(duì)未被去除部分微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)影響, 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)去除率達(dá) 50%左右時(shí)分離上層藻液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在加入 0.15g/L改性粘土和 1.5g/L原土?xí)r, 去除率分別達(dá)到 56%和51%。所以, 本文中各實(shí)驗(yàn)組分別為 0.15g/L改性粘土組、1.5g/L原土組和不加入任何粘土的對(duì)照組。向改性粘土組和原土組分別加入粘土3h后(Wang et al,2011), 取上層未被去除的微藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng), 測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)率和生理生化參數(shù)。

1.3 去除效率、細(xì)胞增長(zhǎng)率、透光率和生理生化參數(shù)的測(cè)定

1.3.1 去除效率(Removal efficiency, RE)的測(cè)定加入改性粘土或原土 3h后, 使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞密度, 去除效率的計(jì)算公式如下

1.3.2 細(xì)胞增長(zhǎng)率(μ)測(cè)定 計(jì)算公式如下

式中： N為細(xì)胞密度, t為時(shí)間, 在本文中時(shí)間間隔取1天。

1.3.3 透光率(T)測(cè)定 小球藻加入改性粘土(或原土)后利用分光光度計(jì)對(duì)藻液進(jìn)行全波長(zhǎng)(200—700nm)掃描, 確定最大吸收波長(zhǎng)為380nm。各實(shí)驗(yàn)組加入改性粘土和原土后分別取樣測(cè)定不同時(shí)刻下的T380, 以此來表示水體的透光率T。

1.3.4 提取酶液 將藻液離心(9500r/min, 5min)收集, 保存于-80°C冰箱。樣品加入1mL磷酸緩沖溶液(pH=7.8)于玻璃研磨器中研磨3min, 再用超聲波破碎儀破碎 10min, 離心(4°C, 5000r/min, 10min)收集上清液, 即為粗酶液, 低溫保存。

1.3.5 生理生化參數(shù)測(cè)定 可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán) G-250法(王學(xué)奎, 2006)。SOD、CAT、APX、GSH-PX和MDA采用南京建成生物工程研究所的相應(yīng)試劑盒測(cè)定。

2 結(jié)果和討論

2.1 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

改性粘土組和原土組小球藻呈現(xiàn)出相似生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖 1), 細(xì)胞密度先下降后增長(zhǎng), 改性粘土組細(xì)胞密度略低于原土組。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過11天左右的生長(zhǎng), 細(xì)胞密度恢復(fù)到粘土處理前, 第 11—22天改性粘土組和原土組平均細(xì)胞增長(zhǎng)率分別為 0.0800/d和0.0771/d, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)前相同細(xì)胞密度區(qū)間(第 5—10天)的平均增長(zhǎng)率(0.200/d), 說明粘土處理抑制了這部分小球藻的生長(zhǎng)(圖 1b—c), 這與以往粘土對(duì)尖刺擬菱形藻(Pseudonitzschia pungens f. multiseries)(俞志明, 1998)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)(孫曉霞, 2001; Lu et al, 2015a)和赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)(孫曉霞, 2001)等生長(zhǎng)的抑制作用研究結(jié)果一致。

圖1 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effect of modified clay flocculation on the growth of Chlorella vulgaris

為了進(jìn)一步探討改性粘土絮凝法對(duì)水體殘留小球藻生長(zhǎng)的抑制作用機(jī)制, 我們分別研究了水體中殘留微藻的可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性以及MDA含量對(duì)粘土加入的響應(yīng)與變化特點(diǎn)。

2.2 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白大多是參與細(xì)胞代謝的各種酶類,將粘土作為外源刺激, 其含量變化可作為了解藻細(xì)胞在此脅迫下的一個(gè)抗逆性指標(biāo)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組可溶性蛋白含量變化相類似, 均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)(圖2)。王麗媛等人(2012)研究了磁性殼聚糖-稀土-粘土復(fù)合樹脂(MCRC)對(duì)赤潮異彎藻的作用, 其可溶性蛋白含量表現(xiàn)出了相似的變化趨勢(shì)。

圖2 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻可溶性蛋白含量的影響Fig. 2 Effect of modified clay flocculation on soluble protein content of Chlorella vulgaris

兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組可溶性蛋白含量均高于對(duì)照組, 改性粘土組可溶性蛋白含量在第 1天達(dá)到最大值(0.486±0.061)×10-8mg/cell, 是對(duì)照組的 3.93倍。原土組可溶性蛋白含量在第 3天呈現(xiàn)出最大值(0.286±0.007)×10-8mg/cell, 是對(duì)照組的 1.69倍。有研究表明重金屬、低溫等逆境條件可引起可溶性蛋白含量增加, 谷巍等(2001)認(rèn)為可溶性蛋白提高, 是植物抵抗毒害的解毒機(jī)制, 可增加細(xì)胞滲透能力和功能蛋白含量, 維持細(xì)胞代謝平衡。本實(shí)驗(yàn)中粘土絮凝對(duì)小球藻造成逆境脅迫, 激發(fā)了藻細(xì)胞的防御系統(tǒng), 這可能是導(dǎo)致可溶性蛋白含量上升的主要因素。

2.3 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻SOD活性的影響

SOD是細(xì)胞抵抗過氧化傷害的第一道防線, 廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中(陳鴻鵬等,2007)。添加改性粘土或原土后, 這兩組的小球藻SOD活性相較于對(duì)照組明顯提高, 而且變化趨勢(shì)相類似, 先上升后下降, 均在 3h達(dá)到最大值(圖3)。有研究表明 SOD 是自然界唯一可以消除 O2-·的酶(Gechev et al, 2006), 本文中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組SOD活性顯著增強(qiáng), 說明添加改性粘土或原土破壞了微藻細(xì)胞代謝平衡, 致使細(xì)胞積累較多O2-·, 從而誘導(dǎo)SOD表達(dá)。歧化O2-·的作用機(jī)理(Mallick et al, 2000)如下：

由此產(chǎn)生的H2O2可再由CAT和APX等酶進(jìn)一步作用分解。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中, 改性粘土組 SOD活性明顯高于原土組, 特別是在加入粘土 3h時(shí), 為原土組的1.96倍(圖3), 這說明同樣去除效果下少量的改性粘土對(duì)殘余微藻細(xì)胞產(chǎn)生的脅迫壓力較大,積累較多O2-·。

圖3 改性粘土絮凝法對(duì)SOD活性的影響Fig. 3 Effect of modified clay flocculation on SOD activity of Chlorella vulgaris

2.4 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻 CAT、APX和GSH-PX活性的影響

作為細(xì)胞內(nèi)消除 ROS的第二道防線(王詠梅,2005), CAT、APX和GSH-PX均能催化分解H2O2。其中CAT與H2O2具有較高的親和力, 能夠清除脂肪酸氧化、光呼吸、線粒體電子傳遞中產(chǎn)生的H2O2, 是H2O2的主要清除劑(陳金峰等, 2008)。由于葉綠體中沒有CAT和GSH-PX等酶, 因此APX是清除葉綠體中產(chǎn)生的 H2O2的關(guān)鍵酶(沈文飚等, 1997)。GSH-PX也是細(xì)胞內(nèi)重要的活性氧消除劑, 主要分布在線粒體和細(xì)胞液中, 阻止ROS對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步傷害(苗雨晨等, 2005; 王詠梅, 2005)。

改性粘土組的CAT、APX和GSH-PX變化趨勢(shì)類似(圖4), 經(jīng)粘土絮凝處理, 各酶活性顯著增強(qiáng), 均在加入粘土1天后達(dá)到最大值, 分別是對(duì)照組的1.27倍、1.94倍和6.65倍, 實(shí)驗(yàn)后期各酶活性有所下降并穩(wěn)定到較高水平。

原土組相對(duì)應(yīng)的各種酶活表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。CAT活性相對(duì)于對(duì)照組沒有明顯變化(圖 4a)。APX活性隨著處理后時(shí)間的延長(zhǎng)先略有下降后迅速增強(qiáng), 在第1天時(shí)達(dá)到最大, 實(shí)驗(yàn)后期APX活性下降并保持在較穩(wěn)定水平(圖 4b)。與其它酶活不同的是,原土組GSH-PX活性高于改性粘土組, 其活性迅速增強(qiáng), 保持在較高水平至第3天(圖4c)。

圖4 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻CAT、APX和GSH-PX活性的影響Fig. 4 Effect of modified clay flocculation on CAT, APX and GSH-PX activity of Chlorella vulgaris

兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中CAT、APX和GSH-PX活性變化幅度各不相同。研究表明 H2O2含量較高時(shí), 才能激發(fā)CAT活性, 若含量較低, 則需要APX等抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)來消除(Gechev et al, 2006)。原土組CAT和 APX活性均低于改性粘土組相應(yīng)活性, 尤其CAT活性相比于對(duì)照組沒有明顯的提高, 但GSH-PX活性卻高于改性粘土組?？赡苁怯捎谠两M對(duì)微藻細(xì)胞脅迫產(chǎn)生的H2O2含量較低, 未能引起CAT活性提高, 為了消除這部分 H2O2, 則需要 APX和 GSH-PX的共同作用。由此說明CAT、APX和GSH-PX作為細(xì)胞內(nèi)酶體防御 ROS的第二道防線, 在消除細(xì)胞內(nèi)H2O2時(shí)互相補(bǔ)充、共同作用。

抗氧化酶在清除細(xì)胞 ROS方面具有十分重要的作用, 其活性變化能夠反映該藻受到逆境脅迫的程度及自身的抗逆能力。侯秀富等(2013)研究表明, 不同粒徑的水體懸浮顆粒物對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的抗氧化酶產(chǎn)生影響, 尤其是0—75μm粒徑組顆粒物對(duì)該藻的影響較大, 該粒徑與本研究所使用的粘土粒徑(Liu et al, 2016)相近, 因此小球藻抗氧化酶活系統(tǒng)對(duì)粘土的響應(yīng)可能與水體懸浮顆粒物相類似。

2.5 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻MDA含量的影響

MDA是生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一, 其含量變化可以反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷程度, 并且 MDA對(duì)細(xì)胞也有毒害作用(劉家忠等, 1999)。改性粘土組和原土組小球藻MDA含量變化呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)(圖5), 隨著粘土處理后時(shí)間的延長(zhǎng), MDA含量迅速增大, 在1天后達(dá)到最大值, 分別是對(duì)照組的2.77倍(改性粘土組)和 2.44倍(原土組), 這表明處理組小球藻細(xì)胞脂質(zhì)受到過氧化傷害, 同時(shí)MDA含量的增加加重了細(xì)胞膜的傷害程度, 可能是由于粘土絮凝對(duì)小球藻形成的逆境導(dǎo)致氧化脅迫, 這與抗氧化酶活性變化相吻合, 并且原土改性后增強(qiáng)了其對(duì)微藻細(xì)胞的氧化損傷。在實(shí)驗(yàn)后期, 該藻MDA含量有所下降, 可能是由于抗氧化系統(tǒng)的作用逐步消除細(xì)胞內(nèi)ROS所致。

圖5 改性粘土絮凝法對(duì)小球藻MDA含量的影響Fig. 5 Effect of modified clay flocculation on MDA content of Chlorella vulgaris

綜合分析本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 水體中殘留的小球藻對(duì)粘土絮凝法的生理生化響應(yīng)主要由于兩部分因素： 一方面這些殘留在水體中的微藻細(xì)胞盡管沒有與粘土顆粒發(fā)生有效絮凝作用, 沉降于水底, 但是絮凝期間會(huì)與粘土顆粒發(fā)生一系列碰撞作用(俞志明等, 1995a, b), 這些看似無效的碰撞仍能對(duì)細(xì)胞表面產(chǎn)生一定的影響, 干擾小球藻的正常代謝, 從而抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng); 另一方面, 在粘土絮凝過程中, 微藻細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境(比如光照、營(yíng)養(yǎng)鹽等)發(fā)生較大變化, 粘土顆粒會(huì)在一定程度上削弱水體的光照強(qiáng)度, 直接影響小球藻的光合作用。孫曉霞(2001)研究發(fā)現(xiàn), 隨著粘土濃度的增大, 對(duì)塔瑪亞歷山大藻和赤潮異彎藻光合作用的抑制增強(qiáng), 而葉綠體是植物產(chǎn)生ROS的主要場(chǎng)所(Asada, 2006), 由此可以推測(cè)粘土顆粒的“遮蔭效應(yīng)”可以使細(xì)胞 ROS積累(俞志明等, 1995a, b), 從而導(dǎo)致抗氧化酶活性和MDA含量等參數(shù)的增加。本研究得到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 經(jīng)粘土處理后透光率迅速下降, 改性粘土和原土組透光率分別是對(duì)照組的75%和25%。在3h時(shí), 改性粘土組的透光率恢復(fù)至與對(duì)照組相同, 但原土組透光率仍比較低, 僅為對(duì)照組的54%, 表明粘土顆粒削弱了水體光照強(qiáng)度, 并且由于原土組粘土顆粒較多, 對(duì)水體光照強(qiáng)度影響較大, 這可能是原土組抗氧化酶活性和MDA含量提高的重要原因。

王小冬等(2012)研究發(fā)現(xiàn), 營(yíng)養(yǎng)鹽限制能夠顯著提高赤潮異彎藻和海洋卡盾藻(Chattonella marina)的抗氧化酶活性。粘土能夠吸附水體中磷酸鹽(俞志明等, 1995a, b), 改變水體氮磷比例, 形成營(yíng)養(yǎng)鹽限制,因此可能會(huì)對(duì)該藻產(chǎn)生氧化傷害, 激發(fā)抗氧化酶活性提高。本研究中改性粘土對(duì)小球藻產(chǎn)生較大氧化脅迫, 可能與改性劑 PAC的協(xié)同作用相關(guān)。本課題組Lu等(2015b)研究發(fā)現(xiàn)PAC改性粘土不僅可以去除大部分總磷, 也可清除總氮, 改變化學(xué)計(jì)量值, 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大營(yíng)養(yǎng)鹽限制, 導(dǎo)致改性粘土組抗氧化酶活性和MDA含量要高于原土組。

3 結(jié)論

改性粘土方法治理赤潮災(zāi)害的主要原理是絮凝藻細(xì)胞至海底, 導(dǎo)致其死亡、分解。除此之外, 該方法對(duì)未被絮凝的藻細(xì)胞有什么影響一直未被關(guān)注。本文以小球藻為模式生物, 考察了改性粘土絮凝后水體中殘余小球藻的生長(zhǎng)率、生理生化性質(zhì)變化等, 發(fā)現(xiàn)赤潮水體經(jīng)改性粘土治理后, 殘余小球藻的生長(zhǎng)受到了明顯抑制。進(jìn)一步考察了其生理生化性質(zhì), 發(fā)現(xiàn)絮凝作用導(dǎo)致殘余藻細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生變化, SOD、CAT、APX和GSH-PX活性增強(qiáng), MDA含量上升等。這些變化可能與改性粘土絮凝過程中的物理撞擊、改性粘土顆粒的“遮蔭效應(yīng)”和營(yíng)養(yǎng)鹽環(huán)境改變等因素有關(guān), 從而導(dǎo)致殘留細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了影響, 難以再次爆發(fā)形成赤潮。上述結(jié)果進(jìn)一步深化了對(duì)改性粘土方法治理有害藻華機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

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