胡麗萍 姜黎明 黃曉婷 包振民

(1. 中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室 青島 266003; 2. 煙臺市水產(chǎn)研究所 煙臺 264003;3. 山東東方海洋科技股份有限公司 煙臺 264000)

紫扇貝(Argopecten purpuratus, Lamarck, 1819)是原產(chǎn)于南太平洋的一種優(yōu)質(zhì)扇貝, 具有出肉率高、味道鮮美、生長快速、抗逆性強、足絲發(fā)達等特點, 當?shù)厣L14—16個月可達商品規(guī)格(9cm), 經(jīng)濟價值高,其加工產(chǎn)品在美國和歐洲深受歡迎, 智利和秘魯?shù)鹊匾验_展大規(guī)模的人工養(yǎng)殖。目前對該扇貝的研究主要集中在生理生態(tài)條件(Navarro et al, 2000, 2006;Díaz et al, 2006; Avenda?o et al, 2008)、殼色遺傳(Winkler et al, 2001)等方面, 分子生物學的研究鮮有報道。青島農(nóng)業(yè)大學王春德教授于2008年從秘魯引進紫扇貝并繁育成功(王春德等, 2009)。但紫扇貝適宜養(yǎng)殖溫度范圍較窄(12—26°C), 在我國北方海區(qū)無法越冬, 山東以南海區(qū)不能度夏, 這給該扇貝的養(yǎng)殖推廣帶來了困難。

海灣扇貝(Argopecten irradians irradians, Lamarck,1819), 原產(chǎn)于美國大西洋沿岸, 于 1982年從美國引進中國(張福綏等, 1986), 以生長快著稱, 且耐溫范圍較廣(-1—31°C), 已成為我國主要扇貝養(yǎng)殖品種(張福綏等, 2000)?？紤]到紫扇貝和海灣扇貝同屬于海灣扇貝屬(Argopecten), 且兩者存在互補性狀, 王春德等(2009)嘗試將引進的紫扇貝和海灣扇貝雜交,成功獲得具有顯著雜種優(yōu)勢的雜交種, 不僅生長迅速、抗逆性也明顯增強, 特別是在山東地區(qū)能夠順利度夏和越冬, 顯示了巨大的產(chǎn)業(yè)潛力。然而, 對于這一全新引進的扇貝物種, 對其遺傳學及種質(zhì)資源的評估資料仍處短缺狀態(tài)。

線粒體 DNA(mtDNA)作為核外遺傳物質(zhì), 具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快等特點, 適合于種群遺傳分析及分子系統(tǒng)進化的研究(Meyer, 1993;Canapaet al, 2000; Sunethaet al, 2000; 辛儉等,2014)。mtDNA中的 16SrDNA序列在種內(nèi)遺傳多樣性和種間系統(tǒng)學關(guān)系的研究中占有重要的地位(Foighilet al, 1995;Schnelderet al, 1999; Lakraet al,2009)。本研究通過測定紫扇貝和海灣扇貝 mtDNA 16S rDNA基因片段序列, 分析了紫扇貝在中國繁殖后代中的遺傳變異趨勢, 并計算了兩個扇貝物種的基因差異和遺傳距離。結(jié)合 GenBank中海灣扇貝屬及我國本土扇貝物種——櫛孔扇貝相應(yīng)片段進行比較并進行系統(tǒng)進化分析, 從分子水平上了解紫扇貝的遺傳背景及其系統(tǒng)進化地位, 以期為扇貝種質(zhì)資源保護及雜交育種策略提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫扇貝和海灣扇貝均于2010年10月下旬取自山東省青島市膠南扇貝養(yǎng)殖場, 養(yǎng)殖水環(huán)境條件為: 水溫16°C, 鹽度30, pH8.2。每個物種各取10個個體, 活體解剖取扇貝閉殼肌, 于液氮冷凍后轉(zhuǎn)-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。其中紫扇貝為引種后繁殖的子一代個體, 平均殼高4.81cm, 平均體重27.36g, 海灣扇貝是從當?shù)仞B(yǎng)殖場中隨機選取個體, 平均殼高4.63cm, 平均體重26.62g。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取和檢測 取約100mg扇貝閉殼肌組織, 采用標準的酚-氯仿方法(Sambrooket al, 1989)提取基因組 DNA, 將乙醇沉淀后的基因組DNA溶解于 100μL的 TE溶液中, 用紫外分光光度計測定其濃度和純度, 然后將基因組 DNA稀釋至50ng/μL, 4°C 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 16S rDNA的序列擴增及序列測定 實驗用16S rDNA引物序列為: 16SF (5′-CGCCTGTTTATCA AAAACAT-3′)和 16SR (5′-CCGGTCTGAACTCAGAT CACGT-3′) (Canapaet al, 2000), 引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)總體積為 50μL, 體系中包括:1×PCR 緩沖液, 1.5mmol/L 的 MgCl2, 0.2mmol/L 的dNTP, 1μmol/L 的正反向引物, 1U 的 Taq DNA 聚合酶(TAKARA), 100ng 的 DNA模板。PCR 擴增反應(yīng)程序: 94°C, 5min預變性; 然后 30個循環(huán), 94°C,45s 變性, 55°C, 45s 退火, 72°C, 1min 延伸; 最后72°C進行5min 延伸, 置于 4°C保存。

取5μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠染色后紫外觀察拍照。剩余 PCR 產(chǎn)物采用Sangon PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行回收及純化, 具體方法按試劑盒說明書步驟進行。純化后的DNA片段測序采用ABI PRISM 3730XL測序儀完成, 測序引物為 PCR 擴增引物。

1.2.3 序列分析 用BioEdit軟件去掉序列兩端不可信部分, 采用 Clustalx1.81進行序列對位排序, 使用Genedoc軟件進行人工校正。然后應(yīng)用 MEGA5.1軟件計算分子變異參數(shù)如多態(tài)性位點, 轉(zhuǎn)換、顛換及插入缺失位點等, 并根據(jù) Kimura雙參數(shù)方法計算遺傳距離。

1.2.4 序列下載 從 GenBank下載 7種海灣扇貝屬扇貝以及外群櫛孔扇貝的16S rDNA同源序列, 序列信息見表1。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)生分析 利用MEGA5.1軟件并根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離, 以櫛孔扇貝作外群, 分別采用鄰接(neibour-joining, NJ)法和最大似然(maximum-likelihood, ML)法對海灣扇貝屬物種構(gòu)建分子系統(tǒng)樹, 采用重抽樣法(Bootstrap)1000檢驗系統(tǒng)樹分枝的置信度。

表1 用于系統(tǒng)分析的扇貝物種及其GenBank注冊號Tab.1 Species used for the phylogenetic analysis and GeneBank accession number

2 結(jié)果

2.1 紫扇貝與海灣扇貝DNA序列組成及變異

經(jīng) PCR擴增, 分別得到了兩種扇貝清晰的 16S rDNA基因片段擴增產(chǎn)物(圖1)。經(jīng)序列測定, 大小均為542bp(含引物序列)(圖2)。通過MEGA5.1對兩種扇貝16S rDNA基因片段序列的平均A、T、G、C含量進行計算, 結(jié)果見表 2。紫扇貝與海灣扇貝的堿基組成差異不大, 相應(yīng)堿基比例相當, 且A+T所占的比例略大于 G+C, 分別為紫扇貝 54.2%和海灣扇貝55.1%。

圖1 紫扇貝和海灣扇貝16S rDNA基因片段的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplified products of 16S rDNA gene fragment in Argopecten purpuratus and Argopecten irradians irradians

圖2 紫扇貝(a)和海灣扇貝(b)的16S rDNA 基因片段核苷酸序列(主導類型)Fig.2 The nucleotide sequences of 16S rDNA gene fragments in A. purpuratus (a) and A. i. irradians (b)

表2 兩種扇貝16S rDNA基因片段長度及堿基組成Tab.2 Base composition of 16S rDNA gene fragment in two scallop species

對紫扇貝10個個體, 海灣扇貝10個個體, 應(yīng)用ClustalX1.81和 MEGA5.1進行種內(nèi)及種間序列的比對分析。種內(nèi)序列分析表明, 紫扇貝和海灣扇貝種內(nèi)不同個體序列間的變異均為轉(zhuǎn)換和顛換導致, 且轉(zhuǎn)換位點數(shù)多于顛換位點數(shù),無插入/缺失變異位點。紫扇貝種內(nèi)序列排序后共檢測到 6個變異核苷酸位點,其中轉(zhuǎn)換核苷酸位點數(shù)為 4個, 顛換位點數(shù)為 2個;共檢測到6種單倍型, 其中主導類型A為5個個體共有, 其余類型僅為某一個體獨有(表3)。海灣扇貝種內(nèi)共檢測到 10個變異核苷酸位點, 其中轉(zhuǎn)換位點 7個,顛換位點3個; 檢測到單倍型共6種, 其中主導類型A為5個個體共有, 其余類型僅為某一個體獨有(表4)。

表3 紫扇貝16S rDNA序列多態(tài)性核苷酸位點及各單倍型分布情況Tab.3 Distribution of variable nucleotides and haplotypes in 16S rDNA fragments of A. purpuratus

表4 海灣扇貝16S rDNA序列多態(tài)性核苷酸位點及各單倍型分布情況Tab.4 Distribution of variable nucleotides and haplotypes in 16S rDNA fragments of A. i. irradians

對紫扇貝和海灣扇貝兩物種間的變異堿基進行統(tǒng)計, 共得到 41個變異位點, 且為轉(zhuǎn)換/顛換位點,無插入/缺失變異。其中轉(zhuǎn)換位點為23個, 顛換位點為16個, 既有轉(zhuǎn)換又有顛換的位點為 2個。兩物種序列的同源性為92.4%。

2.2 海灣扇貝屬物種遺傳分化

紫扇貝和海灣扇貝種內(nèi)遺傳距離范圍分別為0.000—0.009和0.000—0.013, 平均為0.003和0.005。海灣扇貝屬內(nèi)種間遺傳距離見表5。所有物種間的遺傳距離為 0.007—0.120。最小遺傳距離出現(xiàn)在A.irradians和A. nucleus之間(0.007), 而A. i.concentricus與A. ventricosus之間的遺傳距離最大,達到0.120。與紫扇貝A. purpuratus遺傳距離最小的是A. ventricosus, 遺傳距離為 0.031, 而與海灣扇貝A. i. irradians遺傳距離最小的是A. nucleus, 遺傳距離為 0.008, 甚至在海灣扇貝種內(nèi)遺傳距離范圍內(nèi)(0.000—0.013)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

基于16S rDNA基因序列, 應(yīng)用NJ和ML分別重建了系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3), 得到的海灣扇貝屬物種系統(tǒng)發(fā)生樹拓撲結(jié)構(gòu)幾近一致, 大分支節(jié)點的支持率很高。

除外群櫛孔扇貝(C. farrerii)外, 7個海灣扇貝屬物種明顯分為2個單系群, 其中一個單系群包括所有的紫扇貝A. purpuratus和扇貝A. ventricosus, 且置信度為 100%; 另一個單系群包括了其余 5個海灣扇貝屬物種A. irradians、A. i. concentricus、A. i.irradians(包括供試 6個海灣扇貝)、A. nucleus和A.gibbus。該單系群又分為兩個分支, 一個分支僅包含A. gibbus一個種, 其余海灣扇貝屬物種A. irradians、A. i. concentricus、A. i. irradians和A.nucleus聚為另一分支。在NJ樹和ML樹中, 均為A. irradians、A. i.concentricus和部分A. i. irradians個體序列首先聚為一支, 再與其余測試A. i. irradians個體以及A.nucleus聚類。

表5 海灣扇貝屬不同種類間的遺傳距離Tab.5 Genetic distance based on 16S rDNA region among different species of genus Argopecten

3 討論

3.1 16S rDNA序列在貝類遺傳學研究中的應(yīng)用

DNA分子測序技術(shù)的快速發(fā)展, 使得線粒體(mtDNA)基因序列的多態(tài)性分析更為簡單和方便。mtDNA上不同基因因其進化速率不同, 遺傳變異解析能力也不同, 如16S rDNA基因, 已被廣泛應(yīng)用于海洋貝類分子遺傳多樣性研究(Mahidolet al, 2007)、種質(zhì)鑒定(Konget al, 2009)及種屬間的分子系統(tǒng)學研究(Saavedraet al, 2006; Lakraet al, 2009)等。Boulding等(1993)通過對蝦夷扇貝一個養(yǎng)殖群體和兩個野生群體樣品進行16S rDNA基因分析, 檢測到了豐富的遺傳變異; 劉亞軍等(2002)和蘇天鳳等(2005)分別在不同櫛孔扇貝地理種群和近江牡蠣中也檢測到了較高的遺傳變異。李霞等(2009)通過對海扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝16S rDNA同源序列的比對發(fā)現(xiàn),它們分別存在3、7、8、13個差異位點, 核苷酸變異位點較為豐富, 且堿基顛換和插入變異比例大于堿基轉(zhuǎn)換。本研究中, 對紫扇貝和海灣扇貝的16S rDNA基因同源序列檢測分析表明, 兩者種內(nèi)分別存在6和10個差異位點, 核苷酸變異也較豐富。與李霞等(2009)結(jié)論不同的是, 本研究中的紫扇貝和海灣扇貝同源序列間的變異均來自轉(zhuǎn)換或者顛換, 無插入/缺失變異, 且轉(zhuǎn)換位點多于顛換位點。這些變異位點可用于分子系統(tǒng)學和遺傳學的分析。

3.2 扇貝16S rDNA堿基組成及變異分析

在紫扇貝和海灣扇貝檢測樣品中, 4種堿基(A、T、G、C)在兩個扇貝物種中的組成比例相當, 均為C堿基比例較低, 其余三種堿基含量較為接近。對本研究中海灣扇貝屬所有扇貝物種的堿基組成分析后的結(jié)果與之一致, 且均表現(xiàn)為A+T含量高于G+C含量(A+T占比 52.6%—55.5%), 這一結(jié)果與其他研究者在雙殼貝類的16S rDNA、12S rDNA和COⅠ基因堿基組成分析中觀察到的結(jié)果一致(Bouldinget al, 1993;孔曉瑜等, 2001; 李霞等, 2009)。另外, 在頭足類(Anderson, 2000; Zhenget al, 2001)和甲殼類(高天祥等, 2000)等的線粒體基因堿基組成分析中也發(fā)現(xiàn)有類似的現(xiàn)象。推測mtDNA具有較高的A+T含量可能在無脊椎動物中是一種普遍現(xiàn)象。

從遺傳學角度來說, 一個物種種內(nèi)核苷酸變異值的大小在一定程度上反映了物種的遺傳多樣性,而一個物種遺傳多樣性水平的高低與其適應(yīng)環(huán)境、生存及進化能力是緊密關(guān)聯(lián)的(劉亞軍等, 2002)。遺傳多樣性水平降低可能會導致物種的適應(yīng)性和生存能力下降, 并最終導致物種種質(zhì)的衰退。本研究對紫扇貝和海灣扇貝16S rDNA基因片段序列的種內(nèi)變異分析結(jié)果表明, 紫扇貝的遺傳變異水平較海灣扇貝低,這可能是由于紫扇貝試驗樣本作為子一代, 僅由少數(shù)幾個引進親本近交繁育而來, 遺傳背景相對單一導致。

mtDNA上不同基因因其進化速率不同, 遺傳變異解析能力也不同。在本研究中, 16S rDNA基因在紫扇貝和海灣扇貝種內(nèi)個體及種間檢測到的遺傳變異較小, 要進行更為準確和全面的研究, 需要結(jié)合mtDNA其他的基因(如 COI、Cytb等)序列得到多組序列信息, 甚至可以把 mtDNA序列數(shù)據(jù)與核基因組DNA數(shù)據(jù)結(jié)合起來, 共同用于對物種遺傳變異的分析,從而獲得較為客觀、全面的物種遺傳多樣性數(shù)據(jù)。

圖3 應(yīng)用MEGA5.1軟件中鄰接法(NJ, a)和最大似然法(ML, b)構(gòu)建基于16S rDNA序列的海灣扇貝屬系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 The neighbor-joining phylogenetic tree (a) and maximum-likelihood phylogenetic tree (b) constructed based on 16S rDNA sequences of Argopecten species using MEGA5.1

3.3 海灣扇貝屬各物種間的親緣關(guān)系

基于線粒體基因序列探討物種親緣關(guān)系的研究在雙殼貝類研究中已非首例。Canapa等(2000)通過對扇貝科6種扇貝16S rDNA基因序列的比較分析, 探討了這些扇貝物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。Barucca等(2004)采用線粒體16S和12S rDNA基因序列的比較分析,對多種扇貝科物種進行了親緣關(guān)系分析, 其中涉及的海灣扇貝屬物種僅有A. irradians。在Saavedra等(2006)基于16S和12S rDNA基因序列對美國多種雙殼貝類的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究中, 包含的海灣扇貝屬物種也僅有A. purpuratus和A. ventricosus。包含海灣扇貝屬扇貝種類最多的是 Puslednik等(2008)的研究,該研究通過對兩種線粒體基因(16S和 12S rDNA)和一個核基因(H3組蛋白)的序列分析, 對扇貝46個物種構(gòu)建了ML系統(tǒng)發(fā)生樹。其中涉及的海灣扇貝屬5種扇貝被分為兩個大支, 其中一支包含A. purpuratus和A. ventricosus; 另外一支包含其余3個扇貝物種A.irradians、A. nucleus和 A. gibbus, 且 A. irradians和A. nucleus首先聚為一組, 這與我們的研究結(jié)果一致。然而, 對本研究中A. i. irradians(供試海灣扇貝)和A.i. concentricus的系統(tǒng)進化及分子遺傳學分析在以往的研究中均無報道。

A. i. irradians(美國海灣扇貝)最早于1982年引進我國, 是原產(chǎn)于美國大西洋沿岸的一種海灣扇貝, 而A. i. concentricus(墨西哥灣扇貝)同樣屬于美國大西洋沿岸的海灣扇貝亞種, 于 1991年被引入中國并被成功養(yǎng)殖(張福綏等, 1994, 2000)。本研究中, 物種遺傳距離分析結(jié)果表明, A. i. irradians和 A. i.concentricus與海灣扇貝A. irradians的遺傳距離分別為0.009和0.011, 均處于海灣扇貝的種內(nèi)遺傳距離范圍(0.000—0.013)之內(nèi), 而 A. i. irradians與 A. i.concentricus之間的遺傳距離(0.020)卻大于海灣扇貝種內(nèi)的最大遺傳距離, 由此可以做出推測: A. i.irradians與 A. i. concentricus為海灣扇貝種(A.irradians)的兩個不同地理種群, 因受不同環(huán)境條件影響而導致遺傳物質(zhì)發(fā)生改變, 從而分化為海灣扇貝的兩個亞種。同樣的, 從遺傳距離角度考慮, A.nucleus(加勒比海扇貝)與A. irradians、A. i. irradians和A. i. concentricus的遺傳距離分別為0.007、0.008和0.018, 在系統(tǒng)樹構(gòu)建中, A. nucleus與以上三者也最早聚在一起, 表現(xiàn)出與三種海灣扇貝具有非常近的親緣關(guān)系, 僅從 16S rDNA基因分析推測, A.nucleus還未達到種的分化程度, 可將其歸屬海灣扇貝的一個亞種, 然而該結(jié)論還需要更多的證據(jù)來證明。

3.4 雜交育種親本的選擇

雜交育種是貝類新品種選育的基本方法之一,也是培育優(yōu)良品種的重要方法。迄今為止, 國內(nèi)外已有一些貝類雜交的研究報道, 在獲得優(yōu)勢雜種的工作中取得了一定成績(Bower et al, 1997; 常亞青等,2002; 劉小林等, 2003)。在國內(nèi), 很多學者對櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、海灣扇貝以及華貴櫛孔扇貝等多種經(jīng)濟扇貝物種進行了雜交嘗試, 并對雜交子代基因組的組成和變異進行了研究(劉憲杰等, 2006; Huang et al, 2011)。雜交實驗證明了扇貝間的雜交具有可行性,但是, 獲得的雜交子代卻僅發(fā)育到早期幼蟲階段便夭折, 一直未能獲得可成活的雜種成體扇貝。然而,本研究中涉及的紫扇貝和海灣扇貝已被證實其雜交可獲得具有明顯雜種優(yōu)勢的子一代成體(Wang et al,2011; Hu et al, 2013)。在雜交育種工作中, 親本的選配在很大程度上決定了育種計劃的成敗。當兩親本遺傳分化太大時, 可能會因為兩者遺傳物質(zhì)不相容而無法成功獲得雜交后代; 而當兩親本遺傳分化不明顯時, 又會無法產(chǎn)生雜種優(yōu)勢。已有的扇貝雜交試驗也證實了這一點, 對櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、海灣扇貝以及華貴櫛孔扇貝間的雜交均為屬間雜交, 兩親本的遺傳分化較大; 而紫扇貝和海灣扇貝的雜交嘗試卻為屬內(nèi)種間雜交, 親本遺傳分化相對較小, 兩者遺傳物質(zhì)相容, 并可穩(wěn)定遺傳給子代。

通過遺傳分化及聚類分析可以看出, 紫扇貝(A.purpuratus)和海灣扇貝(A. i. irradians)被分在兩個不同的單系群中, 且兩者的遺傳距離為 0.088, 與之類似, 遺傳差異稍大的紫扇貝(A. purpuratus)和墨西哥灣扇貝(A. i. concentricus)(遺傳距離為 0.100)已成功進行雜交試驗, 且雜種后代優(yōu)勢明顯(南樂紅等,2012)。聚在同一個單系群中的扇貝遺傳距離均小于紫扇貝和海灣扇貝的遺傳距離(0.088), 也即遺傳分化較小。鑒于遺傳差異小的親本較易實現(xiàn)雜交, 可考慮將聚在同一個單系群中的扇貝物種用作親本進行雜交育種嘗試。

4 結(jié)論

本研究利用線粒體16S rDNA序列分析了我國兩種引進海灣扇貝屬物種的遺傳變異水平, 并結(jié)合已發(fā)表相關(guān)序列信息對海灣扇貝屬物種進行分子系統(tǒng)發(fā)生分析。研究結(jié)果為海灣扇貝屬物種進化提供參考,為海灣扇貝屬物種的引種以及通過雜交手段開展育種工作提供依據(jù)。此外, 為了更加準確地闡述紫扇貝和海灣扇貝這兩個引進物種的進化關(guān)系以及遺傳變異水平, 綜合利用多種序列和多種分析手段進行討論將是我們下一步需要展開的工作。

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