鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II在大腸桿菌中的表達(dá)及免疫學(xué)鑒定

趙冬敏，黃欣梅，劉宇卓，韓凱凱，楊婧，謝星星，劉曉燕，李銀

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014)

摘要：為了實(shí)現(xiàn)鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白(E蛋白)結(jié)構(gòu)域II在大腸桿菌中的表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，根據(jù)鵝坦布蘇病毒JS804株囊膜蛋白基因序列，利用人工合成法獲得鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II編碼基因并引入限制性酶切位點(diǎn)，片段大小為507 bp。將合成的基因片段克隆入pGEX-4t-1原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-EII并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中。通過優(yōu)化表達(dá)條件獲得重組蛋白質(zhì)并進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。結(jié)果顯示，重組蛋白質(zhì)分子量約為 4.4×10`4，Western-blot和間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明重組蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性。

關(guān)鍵詞：鵝坦布蘇病毒；囊膜蛋白；結(jié)構(gòu)域II

doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2015.03.025

收稿日期：2014-11-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172345);江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2012376)；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)項(xiàng)目[ZX(15)4005]

作者簡(jiǎn)介：趙冬敏(1982-)，女，山東兗州人，博士，副研究員，主要從事家禽重大疫病流行病學(xué)和致病分子機(jī)制研究。(Tel)025-84390047；(E-mail)zhaodongmin126@126.com

通訊作者：李銀，(E-mail)muziyin08@163.com

中圖分類號(hào)：S858.322.5`+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-4440(2015)03-0619-05

Abstract：To express and immunoidentify goose tembusu virus envelope domain II in Escherichia coli, the encoding gene of goose tembusu virus JS804 strain envelope protein domain II was artificially synthesized with the length of 507 bp. The synthesized gene was then inserted into the prokaryotic vector pGEX-4t-1 for the construction of recombinant expression plasmid pGEX-EII and then transformed into E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein with the molecular mass of 4.4×10`4 was successfully expressed in E. coli by optimizing the conditions of expression. Western-blot and IFA revealed the good immunogenicity exhibited by the recombinant protein.

Expression and immunology of domain II of goose tembusu virus envelope protein inEscherichiacoli

ZHAO Dong-min,HUANG Xin-mei,LIU Yu-zhuo,HAN Kai-kai,YANG Jing,XIE Xing-xing,LIU Xiao-yan,LI Yin

(InstituteofVeterinaryMedicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalsEngineeringandTechnology,MinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products,Nanjing210014,China)

Key words： goose tembusu virus；envelope protein;domain II

鵝坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬成員。水禽感染該病毒后，其臨床病癥為卵泡出血、萎縮、變性及瘢痕化，部分出現(xiàn)腦膜出血，食欲急劇減退、產(chǎn)蛋量驟降，群內(nèi)發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為 5%～28%[1-3]。鴨鵝坦布蘇病毒自2010年暴發(fā)以來，已連年在中國(guó)多省大面積流行，并且感染的宿主譜還在不斷擴(kuò)大，蛋鴨、種鴨、雛鴨、蛋鵝、種鵝及蛋雞等均出現(xiàn)坦布蘇病毒感染的病例[4-6]。該病毒病已成為危害中國(guó)鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病之一。

鵝坦布蘇病毒基因組為單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)約為11 kb，包含1個(gè)開放閱讀框架(ORF)，編碼1個(gè)多聚蛋白質(zhì)。囊膜蛋白(E蛋白)是黃病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，由約500個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為 5.5×104～ 6.0×104，2個(gè)囊膜蛋白單體分子以反向平行方式構(gòu)成同源二聚體，90個(gè)E蛋白同源二聚體排列于成熟病毒顆粒的表面[7-8]。囊膜蛋白在病毒吸附,與宿主細(xì)胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要作用。同時(shí)，囊膜蛋白也是黃病毒主要的病毒抗原，含有多種抗原表位，可通過誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。囊膜蛋白屬于II型跨膜蛋白，X射線晶體學(xué)闡明，囊膜蛋白的晶體結(jié)構(gòu)中，β-折疊占絕大多數(shù)，在空間上形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域I、II和III(DI、DII和DIII)。囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II由2個(gè)不連續(xù)片段組成，折疊成指樣結(jié)構(gòu)(Finger-like structure)。該區(qū)域cd環(huán)富含甘氨酸且完全疏水，在幾乎所有的黃病毒屬病毒中均是保守的，它對(duì)病毒的融合活性非常重要，定點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)已證實(shí)它可在囊膜蛋白由二聚體向三聚體轉(zhuǎn)變的過程中插入胞膜，參與病毒與宿主細(xì)胞膜融合，被認(rèn)為是病毒的融合多肽(Fusion peptide)。I和II區(qū)界面存在1個(gè)分子鉸鏈區(qū)，該區(qū)可通過酸性pH介導(dǎo)的構(gòu)象變化使融合多肽移向宿主細(xì)胞膜，并形成融合多肽的突出部分[10-11]。

由于黃病毒屬坦布蘇病毒引起的疫病是新發(fā)疫病，目前尚未見有關(guān)鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II的研究報(bào)道。本研究通過人工合成法合成鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II的編碼基因并克隆入表達(dá)載體pGEX-4t-1中，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組囊膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域II并對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，為進(jìn)一步研究鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能及研制亞單位疫苗打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

鵝坦布蘇病毒JS804株囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II基因核苷酸片段由南京金斯瑞生物有限公司合成。pGEX-4t-1原核表達(dá)載體、宿主菌BL21(DE3)、E蛋白陽(yáng)性血清，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所家禽重大疫病防控項(xiàng)目組保存。

1.2　主要試劑

瓊脂糖凝膠回收試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒等購(gòu)自Axygen公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA marker等購(gòu)自大連寶生物有限公司；GST抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II基因片段的合成

根據(jù)GenBank中登錄的鵝坦布蘇病毒JS804株(登錄號(hào)：JF895923)E基因序列，由南京金斯瑞生物有限公司人工合成結(jié)構(gòu)域II基因片段并分別在5′和3′端加入EcoR I(GAATTC)和SalI(GTCGAC)酶切位點(diǎn)，片段全長(zhǎng)為507 bp。

1.4　重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將合成的結(jié)構(gòu)域II基因片段和pGEX-4t-1質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和SalI雙酶切。用T4 DNA連接酶將酶切后的結(jié)構(gòu)域II基因與pGEX-4t-1載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-EII，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)酶切鑒定后，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定，并進(jìn)行序列分析。

1.5　結(jié)構(gòu)域II蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析

取含重組質(zhì)粒pGEX-EII的陽(yáng)性BL21(DE3)菌液，接種于5 ml含有氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日取100 μl接種于10 ml含有氨芐霉素(100 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá) 0.3～0.4。以終濃度1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別于誘導(dǎo)后0 h、3 h、4 h、5 h取500 μl菌液，12 000r/min離心5 min，棄上清液。沉淀用生理鹽水重懸后與4×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，以pGEX-4t-1空載體進(jìn)行同樣的操作為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳觀察結(jié)果。

1.6　重組結(jié)構(gòu)域II蛋白在菌體中的分布分析

取5 ml 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h的菌液，12 000r/min離心5 min，棄上清液。沉淀用3 ml菌體裂解液重懸，超聲波破碎15 min，12 000r/min離心5 min。分別取上清液和沉淀與4×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳觀察結(jié)果，以確定表達(dá)蛋白質(zhì)存在的位置。

1.7　重組蛋白質(zhì)的Western-blot鑒定

重組蛋白質(zhì)經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，采用濕法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜(NC)上，采用70 V電壓，作用1 h。5% BSA、37 ℃封閉2 h，TBST(0.05% Tween-20)洗滌后分別加入GST標(biāo)簽單抗和E蛋白陽(yáng)性血清并于4 ℃過夜。TBST(0.05% Tween-20)洗滌后加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG于37 ℃孵育1 h。TBST(0.05% Tween-20)洗滌后按照BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說明書顯色。

1.8　鼠抗重組蛋白質(zhì)血清的制備及其效價(jià)的測(cè)定

將純化的重組蛋白質(zhì)與等量弗氏完全佐劑混合并充分乳化后皮下多點(diǎn)免疫BALB/c小鼠，每只免疫重組蛋白質(zhì)的劑量為70 μg，免疫后7 d采集血清。以純化的重組蛋白質(zhì)包被ELISA板，PBST洗滌3次后每孔加入100 μl梯度稀釋的小鼠血清，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后每孔加1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗100 μl，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次，加 入TMB底物避光顯色10 min。以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，450 nm波長(zhǎng)下讀取OD450值。

1.9　間接免疫熒光(IFA)鑒定

利用鵝坦布蘇病毒JS804株感染BHK-21細(xì)胞，感染后4 d棄去培養(yǎng)上清，用無水乙醇固定，加入 1∶50稀釋的鼠抗重組蛋白質(zhì)血清，37 ℃孵育1 h。PBST洗3次，加入 1∶200稀釋的 FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果，以正常BHK-21細(xì)胞作對(duì)照。

2結(jié)果

2.1　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II基因的獲得

利用EcoR I和SalI雙酶切含有結(jié)構(gòu)域II人工合成基因的質(zhì)粒pUC57-simple-EII，獲得大小約為507 bp的片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。

M：DL2000 marker；1：結(jié)構(gòu)域II基因片段。 圖1　人工合成結(jié)構(gòu)域II基因片段 Fig.1　Synthetic domain II gene fragment

2.2　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

提取重組質(zhì)粒pGEX-EII，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到2個(gè)片段，大小與預(yù)期相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明結(jié)構(gòu)域II片段以正確方式插入pGEX-4t-1載體中且序列正確。

1：重組質(zhì)粒pGEX-EII Eco RⅠ和SalⅠ酶切；M：DL2000 marker。 圖2　重組質(zhì)粒pGEX-EII的酶切鑒定 Fig.2　Identification of recombinant plasmid pGEX-EII by enzyme digestion

2.3　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II的誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE分析

將鑒定為陽(yáng)性的細(xì)菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)，pGEX-EII在誘導(dǎo)后4 h出現(xiàn)目的條帶，大小約為 4.4×104的融合蛋白質(zhì)，與預(yù)期蛋白質(zhì)大小一致，在誘導(dǎo)4 h時(shí)表達(dá)量最高(圖3)。

1：蛋白質(zhì)分子量marker；2：pGEX空載體；3～6：誘導(dǎo)后0 h、3 h、4 h、5 h表達(dá)的蛋白質(zhì)。 圖3　pGEX- EII重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測(cè) Fig.3　Analysis of pGEX-EII fusion protein by SDS-PAGE

2.4　重組鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II在菌體中的分布

將誘導(dǎo)表達(dá)5 h的細(xì)菌進(jìn)行超聲波裂解，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)pGEX-EII融合蛋白質(zhì)以包涵體形式存在(圖4)。

1：超聲裂解后沉淀；2：超聲裂解后上清液；3：蛋白質(zhì)分子量marker。 圖4　pGEX-EII重組蛋白質(zhì)在菌體中的分布 Fig.4　Distribution of pGEX-EII fusion protein in recombinant E. coli

2.5　重組鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II的Western-blot鑒定

分別利用GST單抗和囊膜蛋白陽(yáng)性血清Western blot檢測(cè)重組結(jié)構(gòu)域II蛋白，結(jié)果顯示GST單抗和E蛋白陽(yáng)性血清均檢測(cè)到特異性條帶，表明重組結(jié)構(gòu)域II蛋白具有良好的免疫原性(圖5、圖6)。

1：重組結(jié)構(gòu)域II蛋白；2：蛋白質(zhì)分子量marker。 圖5　GST單克隆抗體鑒定pGEX-EII表達(dá)的融合蛋白 Fig.5　Western-blot identification of pGEX-EII fusion protein with GST McAb

1：蛋白質(zhì)分子量marker；2：重組結(jié)構(gòu)域II蛋白。 圖6　E蛋白陽(yáng)性血清鑒定pGEX-EII融合蛋白 Fig.6　Western-blot identification of pGEX-EII fusion protein with positive serum for E protein

2.6　鼠抗重組蛋白質(zhì)血清的制備及其效價(jià)的測(cè)定

用純化的重組蛋白質(zhì)免疫小鼠獲得抗血清后，利用間接ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)。將純化的重組蛋白質(zhì)包被ELISA板，以獲得的小鼠抗血清作為一抗。結(jié)果顯示，免疫后7 d，抗體效價(jià)可達(dá) 1∶800，表明利用大腸桿菌表達(dá)的E蛋白結(jié)構(gòu)域II具有良好的免疫原性，免疫后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。

2.7　間接免疫熒光(IFA)鑒定

用大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白質(zhì)免疫小鼠獲得抗血清后，利用間接免疫熒光對(duì)該血清進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，獲得的血清可與鵝坦布蘇病毒JS804株發(fā)生特異性結(jié)合，表明該血清具有較好的特異性(圖7)。

A：未感染的空白BHK-21細(xì)胞；B：鵝坦布蘇病毒JS804株感染的BHK-21細(xì)胞。 圖7　抗血清的間接免疫熒光鑒定 Fig.7　Indirect immunofluorescence analysis of the murine anti-serum

3討論

2010年4月以來，福建、河北、浙江、山東、江蘇、北京等省市的鴨鵝陸續(xù)暴發(fā)了一種以食欲急劇減退、產(chǎn)蛋量驟降為主要特征的新發(fā)疫病，給鴨鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。研究者通過病原分離和系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷，確定該病由黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病毒感染引起[12-13]。

黃病毒屬病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II內(nèi)的cd環(huán)是病毒的融合多肽，參與病毒與宿主細(xì)胞膜融合。研究結(jié)果表明，該區(qū)某些位點(diǎn)的突變可通過破壞病毒與宿主細(xì)胞膜融合而影響病毒的神經(jīng)毒力。結(jié)構(gòu)域II末端與莖干區(qū)相接觸的b、d和j鏈，以及bc環(huán)上的氨基酸突變均可直接破壞囊膜蛋白外側(cè)與prM和(或)其他囊膜蛋白單聚體之間的作用，并選擇性地改變結(jié)構(gòu)域II頂端的構(gòu)象，干擾融合多肽的出現(xiàn)。因此，黃病毒屬病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II與病毒的致病性密切相關(guān)[14-15]。深入研究鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II將有助于開發(fā)基于囊膜蛋白的新型疫苗和特異性藥物，為鵝坦布蘇病毒病的防控以及抗病毒藥物的設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過基因合成的方法獲得編碼鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II的基因片段，將其插入原核表達(dá)載體pGEX-4t-1中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-EII，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域II。Western blot鑒定結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)可與E蛋白陽(yáng)性血清和GST標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。利用純化后的重組蛋白質(zhì)免疫小鼠，免疫后7 d抗血清效價(jià)可達(dá) 1∶800。間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，該血清可與感染BHK-21細(xì)胞的鵝坦布蘇病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，表明重組蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性。

由于鵝坦布蘇病毒感染在中國(guó)主要鵝養(yǎng)殖地區(qū)廣泛存在，嚴(yán)重危害鵝養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，因此，有效預(yù)防及控制鵝坦布蘇病毒病的發(fā)生和流行越來越受到人們的重視。本研究為進(jìn)一步深入研究鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，此外該重組蛋白質(zhì)也可作為鵝坦布蘇病毒亞單位疫苗的候選疫苗，進(jìn)行疫苗保護(hù)性研究。

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(責(zé)任編輯：張震林)

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