ANXA2對Caco2細胞凋亡的影響

奉艷， 肖麗， 何慧敏， 高寧， 石紅燕， 馬樂樂，

達苗苗， 胥謹慧， 許楠， 劉雨恩， 宋喜貴， 侯穎春*

(陜西師范大學 秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心， 陜西 西安 710119)

摘要：為研究膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)基因與人結直腸癌Caco2細胞凋亡之間的關系，采用RNAi技術沉默Caco2細胞的ANXA2表達后，利用流式細胞儀分析細胞凋亡水平，并利用激光共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡對凋亡細胞進行形態(tài)學檢測。流式細胞儀檢測結果顯示,ANXA2表達被抑制后細胞線粒體正常膜電位發(fā)生改變(P<0.05)，線粒體結構受損；同時，形態(tài)學檢測結果表明,ANXA2表達被抑制后細胞出現(xiàn)了較為明顯的凋亡樣特征。結果提示：ANXA2在人結直腸癌Caco2細胞的高表達能一定程度地促進細胞生長，抑制ANXA2表達可以誘導細胞出現(xiàn)一定程度的凋亡樣形態(tài)特征，但不足以引起細胞廣泛而明顯的凋亡;推測ANXA2表達水平并不是唯一影響瘤細胞凋亡的因素。該結果支持關于ANXA2具有作為腫瘤靶向診斷、治療靶分子潛能的推論。

關鍵詞：膜聯(lián)蛋白A2； 結直腸癌細胞； 細胞凋亡； 基因表達； 基因功能

中圖分類號：R735.3文獻標志碼： A

文章編號：1672-4291(2015)01-0080-06

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2015.01.411

收稿日期：2014-07-09

基金項目：國家社會科學基金資助項目(12BJY131)

The effect of ANXA2 expression on the apoptosis of Caco2 cells

FENG Yan, XIAO Li, HE Huimin, GAO Ning, SHI Hongyan, MA Lele,

DA Miaomiao, XU Jinhui, XU Nan, LIU Yuen, SONG Xigui, HOU Yingchun*

(Co-Innovation Center for Qinba Region′s Sustainable Development,

Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Abstract:To study the relationship between ANXA2 and the apoptosis of Caco2 cells, the expression of ANXA2 in Caco2 cells was inhibited by siRNA. Cell apoptosis was further investigated by flow cytometry (FCM), and morphological characteristics were observed with laser scanning confocal microscopy (CLSM) and transmission electron microscopy (TEM). The results showed that the fluorescence density of the cells was significantly reduced in ANXA2 interfered groups(P<0.05), suggesting that the normal membrane potential of mitochondria has been changed. Moreover, some characteristics of apoptosis cells were also observed in ANXA2 silenced cells compared to control group. Taken together, these results indicate that the excessive expression of ANXA2 in Caco2 cells could promote the proliferation of Caco2 cells. Moreover, some morphological characteristics of apoptosis may be induced by silencing ANXA2 in Caco2 cells, but it is insufficient to cause widely apoptosis or obvious characteristics of cell apoptosis. We suppose that the excessive expression of ANXA2 is not unique route of anti-apoptosis factors of tumor. These results further confirm that ANXA2 has great potential as a targeting molecule of tumor diagnosis and treatment.

Key words: ANXA2; colorectal carcinoma cells; cell apoptosis; gene expression; gene function

膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)是鈣依賴性磷脂結合蛋白多基因家族中的一員[1]，廣泛分布于各種真核細胞膜、細胞質和細胞外，其含量高達細胞總蛋白質的0.5%～2%[2].其功能主要是參與膜轉運及膜表面一系列依賴于鈣調蛋白的活動[3]，包括胞吐作用中的膜融合[4]、囊泡運輸、細胞黏附[5]、細胞增殖[4]、凋亡、DNA復制[6]、信號傳導[7]以及離子通道的形成[8]。ANXA2的異常表達與包括癌癥在內的人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[9-11]，且其作用機理根據腫瘤類型的不同也存在差別[12-14]。

ANXA2在人結直腸癌組織/細胞高表達[15]，有望成為結直腸癌的一個潛在診斷、治療和預后標志物。前期研究表明,Caco2細胞ANXA2的表達量與其增殖、遷移等多種生物學行為能力呈正相關[16]。本實驗將靶向ANXA2的干擾重組質粒導入Caco2細胞后，利用流式細胞儀分析其凋亡水平；利用激光共聚焦顯微鏡觀察經MitoView633染色后細胞的凋亡形態(tài)特征；利用透射電子顯微鏡觀察細胞整體形態(tài)以及內部結構變化；對ANXA2與Caco2細胞凋亡的關系進行初步探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人結直腸癌細胞株Caco2購自美國ATCC,本實驗室保存。

1.1.2重組質粒設計靶向ANXA2的干擾質粒pU6H1-GFP-siANXA2-1(5′-TGTGTGGTGGAGATGACTGA-3′)和錯義對照質粒pU6H1-GFP-siRNASCR(5′-GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC-3′)由百奧生物技術(南通)有限公司構建合成。

1.1.3儀器與試劑DMIL LED倒置熒光顯微成像系統(tǒng)(德國Leica公司)，激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Leica公司)，JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡(日本電子公司)，流式細胞儀(Millipore)；DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產品，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物公司，鏈霉素、青霉素、慶大霉素及胰蛋白酶購于西安沃爾森公司， Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ為Omega產品，S-TranG轉染試劑購自南京探求生物技術公司， MitoView 633購自美國Biotium公司，電鏡級戊二醛固定液為Sigma產品。

1.2方法

1.2.1質粒制備 pU6H1-GFP-siANXA2-1和pU6H1-GFP-siRNASCR質粒的制備按Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ說明書進行。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉染 Caco2細胞用DMEM培養(yǎng)基(含10 % FBS、100μg/mL鏈霉素、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素)于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)。將對數(shù)生長期細胞以2.5×105接種于含蓋玻片的培養(yǎng)皿(30 mm)，使細胞融匯率在24 h內達60%~70%，此時參照S-TranG試劑說明書進行質粒pU6H1-GFP-siANXA2-1(實驗組，A1)和pU6H1-GFP-siRNASCR(對照組，NT)細胞轉染。同時設野生組(WT，以PBS代替質粒用量)，每24 h更換一次培養(yǎng)基。轉染60 h后，利用倒置熒光顯微成像系統(tǒng)以細胞GFP表達情況估算轉染效率：轉染效率=綠色熒光細胞數(shù)/相同視野下細胞總數(shù)×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測 取轉染后96 h的各組培養(yǎng)皿， PBS洗去漂浮細胞；加MitoView 633工作液(母液用DMEM培養(yǎng)基按1∶100比例稀釋)覆蓋整皿細胞，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗去多余染液；0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞；DMEM終止消化，制成細胞懸液；細胞計數(shù)，調整細胞密度至200個/μL；加樣于96孔板，每孔200 μL，每組設兩個復孔，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.4激光共聚焦掃描顯微鏡觀察 取轉染后96 h的各組蓋玻片，PBS洗去漂浮細胞；滴加MitoView 633工作液于蓋玻片，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗去多余染液；甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察成像(MitoView 633激發(fā)光波長633 nm)。

1.2.5透射電子顯微鏡觀察取轉染后96 h各組細胞用DMEM制成懸液；室溫，800 r/min離心3 min；棄上清，重懸于1 mL 37 ℃預熱的PBS，轉移至1.5 mL EP管；室溫，1 000 r/min離心10 min；棄上清，加入約500 μL 2.5%戊二醛固定液，4 ℃固定細胞24 h；預冷PBS洗細胞，1%鋨酸進行再固定；梯度酒精脫水；環(huán)氧樹脂包埋；常規(guī)超薄切片制樣；醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色；透射電子顯微鏡觀察，數(shù)碼成像系統(tǒng)進行圖像采集。

2 結果

2.1質粒轉染效率評估

以S-TranG試劑轉染重組質粒60 h后細胞GFP的表達如圖1所示。轉染效率>80%。

圖1　轉染60 h后Caco2細胞轉染效率評估

2.2流式細胞儀檢測caco2細胞凋亡

線粒體跨膜電位的降低是細胞凋亡早期的不可逆事件，引起一系列線粒體相關變化。MitoView 633是一種遠紅外線粒體熒光染料，在正常細胞中依據線粒體膜電位的存在，逐漸擴散進質膜并沉積在線粒體內，在激發(fā)光下放出熒光。流式細胞儀結果顯示(圖2)：轉染96 h后，相較于野生組(WT)、對照組(NT)，ANXA2抑制組(A1)熒光強度有明顯的降低(P<0.05)，表明A1組細胞線粒體的正常膜電位降低或者消失，導致MitoView 633染料不能透過質膜或者透過質膜卻在線粒體基質的沉積量有所減少，進而顯示為熒光強度的減弱。

圖2　流式細胞儀檢測Caco2細胞線粒體膜電位變化

2.3激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

MitoView 633染色細胞線粒體結果顯示(圖3)：轉染96 h后，WT(野生組)、NT(對照組)細胞線粒體發(fā)出明亮的紅色熒光；而ANXA2干擾組細胞線粒體僅發(fā)出微弱的紅色熒光，偶見明亮的紅色熒光團(箭頭所示)。此結果與流式細胞儀量化分析結果一致(圖2)。

圖3　Caco2細胞經MitoView 633染色后激光

2.4透射電子顯微鏡觀察

透射電鏡觀察結果顯示(圖4)：轉染96 h后，野生組細胞多呈圓形或橢圓形；細胞質膜結構完整、輪廓清晰；細胞質濃密均勻(圖4a)。對照組細胞內部超微結構與野生細胞基本一致(圖4b)。ANXA2表達抑制組細胞內部超微結構發(fā)生了變化。主要表現(xiàn)在：細胞輪廓模糊，質膜受損(分層、斷裂等)嚴重；胞質結構疏松混亂，胞漿內散在大量膜性空泡；核內染色質濃縮且邊緣化(圖4c)。

圖4　Caco2細胞透射電子顯微鏡觀察結果

3討論

細胞凋亡是多細胞生物發(fā)育過程中不可或缺的一種自穩(wěn)機制。腫瘤組織由于無限制的生長需要，常需要抑制自身的細胞凋亡，而出于腫瘤治療的目的，腫瘤細胞需要被誘導凋亡。細胞凋亡是多基因嚴格控制的過程，具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制?，F(xiàn)有資料顯示：腫瘤發(fā)展過程中，其抗細胞凋亡能力明顯加強，瘤細胞凋亡率明顯降低[17]。研究表明，許多腫瘤相關基因在腫瘤細胞抑制凋亡過程中扮演了重要角色[18]。所以，這種“凋亡抑制”促進了腫瘤的生長失控、轉移等特點[19]。某些腫瘤治療研究策略就是通過加強腫瘤細胞凋亡誘導機制，抑制其抗凋亡基因表達。

據報道,ANXA2與多種腫瘤的發(fā)生進程相關，可以調節(jié)腫瘤細胞的增殖、運動等，并參與調節(jié)表皮生長因子受體( EGFR)信號傳導途徑，通過酪氨酸殘基磷酸化將外界信號傳導至細胞內，再通過Ras和PI3K途徑將信號傳遞至細胞核，調控靶基因表達[20]。ANXA2也可參與抑癌基因p53誘導的細胞抗凋亡路徑[21]。沉默ANXA2表達后發(fā)現(xiàn)淋巴瘤Jurkat細胞凋亡水平增加，表明ANXA2 基因在 Jurkat 細胞生長過程中可以拮抗凋亡[22]。研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶-3和Omi/HtrA2可以誘導ANXA2裂解，進而阻抑細胞周期，促進細胞凋亡[23]。降低ANXA2表達后，細胞對死亡反應敏感，可能與NF-jB信號前體的活性降低相關[24]，也可通過上調COX-2 基因表達進而上調NF-kB表達以拮抗凋亡[25]。ANXA2可能會調節(jié)一些凋亡相關蛋白因子(如Caspases8、p53、Bcl2等)的表達活性，抑制細胞內相關凋亡信號通路[26]。但是，腫瘤細胞的抗凋亡機制有多種信號途徑參與[27]，ANXA2途徑不是促瘤細胞抗凋亡的唯一途徑。

本實驗通過抑制人結直腸癌Caco2細胞ANXA2表達，研究ANXA2基因與腫瘤細胞凋亡的關系。流式細胞儀檢測結果顯示(圖2)：轉染96 h后，ANXA2表達抑制細胞的線粒體熒光強度明顯降低，表明其線粒體的正常膜電位發(fā)生改變，提示細胞的凋亡趨勢。激光共聚焦顯微鏡檢測結果顯示(圖3)：轉染96 h后，對照組細胞線粒體發(fā)出明亮的紅色熒光，細胞凋亡趨勢不明顯；而ANXA2抑制細胞，凋亡趨勢明顯：線粒體僅發(fā)出微弱的紅色熒光，偶見明亮紅色熒光團，推測其可能是凋亡后期核染色質斷裂為大小不等的片段與線粒體一起聚集，為反折的細胞膜包圍，形成凋亡小體所致。透射電鏡觀察結果顯示(圖4)：ANXA2表達抑制細胞體積縮小，胞質結構混亂,胞漿中出現(xiàn)膜性空泡，膜性細胞器散亂分布等；染色質濃縮、凝聚、邊緣化分布。

本實驗室構建的ANXA2敲除的結直腸癌細胞系(ANXA2-/-Caco2)復蘇后不易貼壁，生長遲緩，但細胞仍能正常存活，說明ANXA2表達不是唯一影響瘤細胞凋亡的因素，但與敲低相比，敲除ANXA2基因能更有力地抑制癌細胞的增殖、遷移、浸潤等能力。

總之，本研究運用RNAi技術下調Caco2細胞的ANXA2表達，細胞出現(xiàn)了一定程度的凋亡現(xiàn)象，說明ANXA2的表達與癌細胞的增殖、抗凋亡相關，但ANXA2的高表達可能不是Caco2細胞強大增殖力、抗凋亡力的唯一誘導因素。

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〔責任編輯王勇〕

第一作者：馮慶，女，博士研究生，研究方向為旅游經濟運行分析。E-mail: fengbecky@hotmail.com

*通信作者：孫根年，男，教授，博士生導師。E-mail:gnsun@snnu.edu.cn