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腦泰方對動脈粥樣硬化兔氧化應激的影響研究

劉吉勇1，朱惠斌2，陳懿3，王國佐3，易亞喬3，葛金文3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷研究所湖南省重點實驗室湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院湖南長沙410007；3.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的觀察腦泰方對動脈粥樣硬化兔氧化應激的影響，探討腦泰方抗動脈粥樣硬化的作用機制。方法采用“高脂飼料喂養(yǎng)+免疫刺激方法”建立動脈粥樣硬化兔模型，模型成功后隨機分為腦泰方組、模型組、阿托伐他汀組，另設空白對照組，每組10只。藥物干預后，采用酶聯(lián)免疫法測定兔血清SOD、MDA及ox-LDL含量；采用PCR及Western Blot技術(shù)檢測LOX-1、VCAM-1、ICAM-1及MCP-1相關基因及蛋白表達情況。結(jié)果模型兔SOD較空白對照組顯著降低（P<0.01)，MDA及ox-LDL顯著升高（P<0.01)，主動脈LOX-1、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1mRNA和蛋白表達較對照組顯著升高（P<0.01)。藥物干預后，與模型組比較，腦泰方組兔SOD明顯升高（P<0.01)，MDA及ox-LDL含量明顯降低（P<0.01)，LOX-1、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1 的mRNA和蛋白質(zhì)表達明顯下降（P<0.01)。結(jié)論腦泰方可能通過增強抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化程度及保護血管內(nèi)皮的途徑而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

〔關鍵詞〕腦泰方；動脈粥樣硬化；氧化應激；黃芪；川芎；地龍

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)引起的心腦血管疾病嚴重危害著人類健康，在歐美一些國家已經(jīng)成為危及人類健康的一號殺手。在引起動脈粥樣硬化的眾多因素中，高膽固醇血癥、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應是重要的危險因素，但動脈粥樣硬化的發(fā)病機制較為復雜,至今尚不明確。近年大量研究證實，氧化應激(oxidative stress OS)貫穿動脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展及斑塊破裂觸發(fā)臨床事件的始終，被認為是其致As發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一[1]。氧化應激主要通過氧化作用、誘導血管基因表達，促進局部炎癥反應和細胞增殖等多方面參與動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[2]。中醫(yī)認為As多為本虛標實，本虛以氣虛為主，標實以血瘀、痰濁為主[3]。中藥復方多成分、多靶點的整體調(diào)治符合動脈粥樣硬化復雜的病機特點，且療效穩(wěn)定，副作用小。腦泰方是由補陽還五湯化裁而成的治療動脈粥樣硬化的臨床有效驗方。前期研究表明，腦泰方能提高纖溶酶原激活物（t-PA）的活性，抑制血小板的聚集，具有抗血栓形成、促進纖溶活性的作用[4]。本研究基于氧化應激角度，進一步探討其對氧化應激相關效應分子的影響，以期明確其抗As的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物

1.2實驗藥物

腦泰方：由黃芪、地龍、川芎等組成，由湖南中醫(yī)藥大學制劑實驗室提供的中試樣品，批號為20090801，含生藥2 g/g。阿托伐他汀鈣：Pharmaceuticals，產(chǎn)品批號：5837030。

1.3主要試劑

牛血清白（蛋白Roche公司）；SOD、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ox-LDL ELISA試劑盒（美國CSF公司）；MCP-1抗體（Abcam公司）；VCAM-1抗體、ICAM-1抗體、LOX-1抗體(Santa cruz biotechnology公司)；卵血清白蛋白、小鼠Actin、制膠、電泳和轉(zhuǎn)膜試劑（美國Sigma公司）；HRP標記兔抗小鼠二抗（KPL公司）；蛋白抽提試劑盒、HaltTM蛋白酶抑制劑、SuperSignal West Femto超靈敏化學發(fā)光底物、BCA protein定量試劑盒（Pierce公司）；PVDF膜、SeeBlue Plus蛋白預染Marker、Trizol Reagent（美國Invitrogen公司）；RTPCR試劑盒(大連Takara生物公司)；TBE電泳緩沖液、100-1000bp DNA marker(北京天根生物公司)。

2　方法

2.1動物分組

動物給予普通飼料適應性飼養(yǎng)1周。采用隨機數(shù)字表法分為空白組，模型組，腦泰方組，阿托伐他汀組，每組20只。均單籠飼養(yǎng)，飲水不限，自由攝食，每天每只予150 g飼料。

2.2造模方法

黍粒小，播種淺加上春天風大、干旱，如果種子不能與土壤緊密結(jié)合，種子難以吸水發(fā)芽，因此黍子播種后及時鎮(zhèn)壓1-2次。

除空白組外，其他組參照文獻[5]采用喂高脂飼料加血管內(nèi)膜免疫刺激方法進行造模。高脂飼料按普通飼料79%、膽固醇1%、豬油5%、蛋黃粉15%比例配制。造模第1天從兔耳緣靜脈注射牛血清白蛋白進行免疫刺激(25 mg/kg，1次/周，共注射3次)，之后用卵清白蛋白進行皮下注射(2.5 mg/kg，1次/2 d，共5次)，造模時間8周,通過檢測血脂及主動脈病理檢測評判模型的成功，最終篩選出每組10只。

2.3給藥方法

模型成功后，開始灌胃給藥，每天1次，灌胃時間1個月。各藥物劑量根據(jù)70 kg成人每日臨床推薦的常用劑量及人兔體表面積換算為等效劑量。阿托伐他汀組予阿托伐他汀混懸液灌胃，劑量為0.435 mg/（kg·d），腦泰方組為0.2 g/（kg·d）；正常對照組、模型組予生理鹽水灌胃。

2.4指標的檢測及方法

2.4.1血清SOD、MDA、ox-LDL的測定用黃嘌呤氧化酶法檢測總SOD活力；硫代巴比妥酸反應法測定血清丙二醛（MDA）；夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定血清ox-LDL的含量；操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.4.2兔胸主動脈ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、LOX-1 mRNA表達采用RT-PCR法檢測。按照試劑盒說明書提取胸主動脈組織的總RNA，以1.5 %凝膠電泳分析總RNA的完整性，用紫外分光光度計測A260 nm和A280 nm值進行定量。逆轉(zhuǎn)錄反應（RT）操作參照大連TaKaRa公司提供的RT-PCR試劑盒說明書，建立10μL反應體系，將反應體系快速混勻一次，按以下條件進行RT：30℃10 min；42℃30 min；99℃5 min；5℃5 min。RT產(chǎn)物立即行PCR試驗，建立10 μL PCR擴增反應體系，PCR反應條件：ICAM-1的擴增條件：95℃1 min；95℃30 s，57℃30 s，72℃40 s，共30個循環(huán)，72℃延伸5 min；VCAM-1的擴增條件：95℃1 min；95℃30 s，59℃30 s，72℃40 s，共32個循環(huán)，72℃延伸5 min；MCP-1的擴增條件：95℃1 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，共35個循環(huán)，72℃延伸5 min；LOX-1的擴增條件：95℃1 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共30個循環(huán)，72℃延伸5 min，PCR產(chǎn)物5 μl 與5×loading buffer 1 μL混勻后，加入1.5%瓊脂糖凝膠板，100 V恒電壓電泳20 min后紫外燈光下觀察條帶，并應用自動電泳凝膠分析系統(tǒng)對每一樣品PCR產(chǎn)物擴增的特異性片段進行光密度掃描，并以β-actin密度作為參考定量標準，分析電泳結(jié)果。引物序列見表1。

表1　引物名稱、序列及擴增長度

2.4.3腹主動脈ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、LOX-1蛋白的表達采用Western-Blot法檢測。按照試劑盒操作要求，首先提取腹主動脈組織總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，取出膜，裝入保鮮膜袋中，加稀釋的一抗體（1:5 000），37℃孵育1 h。洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3 000），用ECL進行顯色，放入暗盒中曝光、顯影、定影。凝膠圖像處理系統(tǒng)測定目的條帶的光密度值，計算其與Actin光密度值的比值，即相對光密度。

2.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0處理及分析數(shù)據(jù)。計量資料以“x±s”表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，多均數(shù)組比較進行方差齊性檢驗后采用用One-Way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法。

3　結(jié)果

3.1血清SOD、MDA、ox-LDL分析結(jié)果

與空白組比較，模型組血清MDA、ox-LDL含量明顯升高(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，腦泰方組血清SOD活力升高，血清MDA、ox-LDL含量降低（P<0.01，P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2　各組家兔血清SOD、MDA、ox-LDL含量　（x±s，n=10）

3.2胸主動脈LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 mRNA基因表達結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組LOX-1、MCP-1、ICAM-1及VCAM-1 mRNA的表達明顯升高（P<0.01），與模型組比較，腦泰方組LOX-1、MCP-1、ICAM-1及VCAM-1 mRNA的相對表達量明顯下降（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果見表3、圖1。

圖1　PT-PCR檢測各組兔胸主動脈LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1基因表達

Western-blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組腹主動脈LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，腦泰方組腹主動脈LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達明顯下降（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

表3　各組家兔胸主動脈基因表達水平變化?。▁±s）

表4　各組家兔腹主動脈蛋白表達水平變化　（x±s）

圖2　Western-Blot檢測各組兔腹主動脈LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達

4　討論

本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)加免疫刺激方法復制動脈粥樣硬化兔模型，大量研究表明,高脂血癥可導致氧自由基及其他活性成分釋放增多，引起動脈內(nèi)皮損傷[6]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，MDA含量多少可以間接反映出機體組織中氧自由基含量的變化以及氧自由基引起脂質(zhì)過氧化程度，從而可以判斷組織損傷程度，是常用的膜脂過氧化指標，脂質(zhì)過氧化損傷在冠心病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病中日益受到重視。SOD是機體內(nèi)天然存在的氧自由基清除因子，它在維持機體氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡中起著重要的作用，檢測SOD的含量的高低可以間接反映出機體清除自由基的能力。因此檢測SOD，MDA的含量可反映機體清除氧自由基的能力和脂質(zhì)過氧化程度[7]。

氧修飾LDL形成的ox-LDL是內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞損傷的主要原因，其本身對單核細胞有趨化作用，能促使內(nèi)皮細胞產(chǎn)生巨噬細胞集落刺激因子和趨化因子，從而刺激新的單核細胞進入病變及單核細胞源的巨噬細胞復制。正常情況下，血管內(nèi)膜表面無炎癥，但氧化應激時很多促炎性因子刺激劑誘導內(nèi)皮細胞黏附分子表達，導致單核細胞黏附，最終形成As損傷。氧化應激是As炎癥反應的始動因素，其中ROS及其修飾LDL形成的ox-LDL是內(nèi)皮細胞損傷和誘導內(nèi)皮細胞促炎性因子表達的主要原因[8]。大量研究結(jié)果證實，在早期As形成過程中，血管內(nèi)皮細胞黏附分子的表達與白細胞相互黏附具有重要的病理生理學意義[9]。本研究結(jié)果進一步證實，隨著機體氧化應激作用增強，體內(nèi)脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量增高，SOD活性顯著降低，體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，過量的ROS及具有細胞毒性作用的氧化型LDL能誘導內(nèi)皮細胞促炎性因子表達和加劇內(nèi)皮細胞損傷。本實驗PCR結(jié)果顯示模型組MCP-1、ICAM-1、VCAM-1等促炎癥因子呈過表達。

腦泰方是臨床治療動脈粥樣硬化氣虛痰凝，痰瘀互結(jié)證的有效方劑，方中以黃芪為君藥，借其力專、性走，周行全身，大補脾胃元氣，令氣旺則血活，血活則瘀除，以治其本；川芎活血行氣，氣行則血行，是為臣藥；地龍通經(jīng)活絡，化痰熄風，是為佐藥。諸味配合，共奏益氣、活血、化瘀、祛痰之功效。既往研究顯示，腦泰方對血脂、血管微循環(huán)、血液流變學、血液凝血與纖溶系統(tǒng)、促進血管新生方面有一定影響[10-11]。本研究結(jié)果顯示，腦泰方能降低血脂，降低脂質(zhì)過氧化MDA的產(chǎn)生，增強SOD酶抗氧自由基的活力，減少ox-LDL的生成，從而保護內(nèi)皮細胞，改善機體氧化應激狀態(tài)。ox-LDL能誘導內(nèi)皮細胞LOX-1受體表達及誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生粘附分子，腦泰方可能通過抑制這一作用機制，從而下調(diào)LOX-1、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的表達，減少了內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞對ox-LDL的攝取，從而抑制泡沫細胞的形成，進而保護內(nèi)皮功能及抑制As的發(fā)生發(fā)展，其治療作用與阿托伐他汀無明顯差異。

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（本文編輯楊瑛）

著密切聯(lián)系，CaMK IV作為CaMK家族中的一員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達較豐富。CaMK IV作為CREB的上游基因之一，對CREB的磷酸化發(fā)揮著重要作用。CaMK IV可通過p-CREB參與學習、記憶的鞏固和維系，CaMK IV-CREB信號通路直接參與了LTP的形成，是維持學習、記憶功能的重要通路[10]；同時在神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性及基因表達等方面發(fā)揮著重要作用。

Effects of Naotaifang on Oxidative Stress in Rabbits with Atherosclerosis

LIU Jiyong1, ZHU Huibing2，CHEN Yi3, WANG Guozuo3, YI Yaqiao3, GE Jinwen3*

（1. Hunan Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine,Changsha, Hunan 410007, China;2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha, Hunan 410007, China; 3.Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases Prevention and Treatment of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

Abstract〔〕Objective To observe the effects of Naotaifang on oxidative stress in rabbits with atherosclerosis and investigate its molecular mechanisms. Methods The atherosclerosis rabbit models were prepared by feeding the high fat diet and immune stimulation. After the success of the model animals were randomly divided into Naotaifang group, model group, atorvastatin group and blank control group(n =10). After drug intervention，the serumsuperoxide dismutase(SOD)activity，malondialdehyde(MDA)and oxidized low density lipoprotein(ox-LDL)levels in rats were detected by enzyme linked immunosorbent assays. The LOX-1, VCAM-1, ICAM-1 and MCP-1 related gene and protein expression were detected by using PCR and Western Blot technology. Results Compared with the control group, serum SOD activity in tat models was significantly decreased(P<0.01), serum MDA，ox-LDL was significantly higher(P<0.01); mRNA and protein expression of aortic LOX -1，VCAM -1，ICAM -1，and MCP -1 were significantly increased(P <0.01)．After medicine intervention, compared with model group，SOD in rabbits of Naotaifang group was increased significantly(P<0.01), MDA and ox-LDL were significantly lower(P<0.01), mRNA and protein expression of aortic LOX-1，VCAM-1，ICAM-1，and MCP-1 were significantly lower(P<0.01). Conclusion Naotaifang has anti-atherosclerotic effects, it may through enhancing antioxidant capacity, reducing lipid peroxidation and protecting the vascular endothelium pathways.

Keywords〔〕Naotaifang; atherosclerosis; oxidative stress; milkvetch root；rhizoma ligustici；lumbricus

〔通訊作者〕*葛金文，男，教授，博士研究生導師，E-mail：cmgjw@tom.com。

〔作者簡介〕劉吉勇，女，碩士，講師，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病研究。

〔基金項目〕湖南省科技廳項目（2012IP4018-2）；湖南省教育廳項目（600110410）；國家重點學科中醫(yī)診斷學開放基金（2014）；湖南中醫(yī)藥大學青年教師科研基金資助。

〔收稿日期〕2015－01－16

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.10.007

〔文獻標識碼〕B

〔中圖分類號〕R285.5;R256.22