劉　芹1,耿雪冉2,許瀛引2,柳萬(wàn)石,王賀祥

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南鄭州　450002；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100193；

3.金亨稷師范大學(xué)，平壤　999093)

雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用

劉芹1,耿雪冉2,許瀛引2,柳萬(wàn)石2,3,王賀祥2*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南鄭州450002；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；

3.金亨稷師范大學(xué)，平壤999093)

摘要：探討雞腿菇復(fù)合制劑的護(hù)肝作用，為雞腿菇復(fù)合制劑的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).通過對(duì)昆明小鼠灌胃不同劑量的雞腿菇復(fù)合制劑，測(cè)定小鼠的轉(zhuǎn)氨酶(GOT，GPT)、丙二醛(MDA)、抗氧化酶(SOD，GSH-PX)水平,觀察肝臟的組織病理變化，研究雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)CCl4造成的急性肝損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用.結(jié)果表明,灌胃雞腿菇復(fù)合制劑可明顯降低血清中轉(zhuǎn)氨酶(GOT,GPT)和肝臟中丙二醛(MDA)的水平(P<0.05)，提高肝臟中抗氧化酶(SOD,GSH-PX)的水平.病理組織切片顯示，造模小鼠肝組織存在大面積壞死區(qū)域和脂滴累積，雞腿菇復(fù)合制劑在低、中、高三個(gè)劑量時(shí)均可減輕肝組織受損程度，其中低劑量的效果更為明顯，說明雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠肝臟具有明顯的保護(hù)作用.

關(guān)鍵詞：雞腿茹復(fù)合制劑；CCl4；肝臟；保護(hù)

收稿日期：2015-06-11;修改稿收到日期:2015-07-12

*通訊聯(lián)系人，男，教授，博士.主要研究方向?yàn)樗幱门c食用真菌.E-mail:hxwang@cau.edu.cn

E-mail:liuqin_bio@163.com

基金項(xiàng)目:現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金(CARS-24)

作者簡(jiǎn)介：劉芹(1986—)，女，河南永城人，博士.主要研究方向?yàn)樗幱门c食用真菌.

中圖分類號(hào)：R 965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：章編號(hào)：1001-988Ⅹ(2015)06-0083-05

Abstract:The hepatoprotective potential of Coprinus comatus-compound is discussed in vivo using a hepatotoxicity model of CCl4-induced liver injury.Neutralization of CCl4-induced hepatotoxicity by Coprinus comatus-compound is evaluated in mice.Towards this,serum levels of hepatic injury markers(glutamic-oxaloacetic transaminase and glutamic-pyruvic transaminase),malondialdehyde and antioxidant enzymes (superoxide dismutase and glutathione peroxidase) in the liver homogenates,and histological examination are performed.The results show that administration of Coprinus comatus-compound can significantly prevente the elevation in serum glutamic-oxaloacetic transaminase(GOT) and glutamic-pyruvic transaminase(GPT) activities in acute liver damage induced by CCl4 and suppressed hepatic malondialdehyde(MDA) formation.Mice treated with Coprinus comatus-compound is demonstrated a better profile of antioxidants with augmented activities of superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSH-PX) in the liver.The results indicate that Coprinus comatus-compound has significant protective effect against acute hepatotoxicity induced by CCl4,and has been supported by the evaluation of liver histopathology in mice.

TheprotectiveeffectofCoprinus comatus-compound

onCCl4-induced acute liver injury of mice

LIUQin1,GENG Xue-ran2,XU Ying-yin2,RYN Mansok2,3,WANGHe-xiang2

(1.InstituteofPlantNutritionandResourceEnvironment,HenanAcademyofAgriculturalSciences,

Zhengzhou450002,Henan,China;

2.StateKeyLaboratoryforAgrobiotechnologyandDepartmentofMicrobiology,ChinaAgriculturalUniversity,

Beijing100193,China;

3.D.P.R.KoreaPyongyangKimHyongJikUniversityofEducation,Pyongyong999093,NorthKorea)

Keywords:Coprinus comatus-compound;CCl4;liver;protection

肝臟是人體最大、功能最復(fù)雜的實(shí)質(zhì)性腺體，參與消化、代謝、解毒和免疫等多個(gè)過程[1].各種致病因子如機(jī)械損傷、病毒感染、化學(xué)毒物(CCl4、酒精等)、寄生蟲感染以及高脂食物等均能引起肝細(xì)胞受損，導(dǎo)致肝臟疾病發(fā)生[2].近年來(lái)對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用的天然藥物的研究備受關(guān)注，顯示了天然藥物抗肝損傷、護(hù)肝降酶的美好前景[3,4].雞腿菇復(fù)合制劑主要是由雞腿菇等多種食用菌及中草藥組成，是一種功能性食品，由于其具有作為天然藥物的潛力，目前正處于研究和申報(bào)階段.本研究利用CCl4建立肝損傷模型，探究此制劑對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)為天然藥物提供理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1藥品及主要試劑

雞腿菇復(fù)合制劑由蘇州佛果生物科技有限公司提供，主要成分為雞腿菇、猴頭菇、金針菇、草菇、香菇、茯苓、人參、枸杞子、佛手等.

谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamicoxalacetictransaminase，GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamatepyruvatetransaminase，GPT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GSH-PX)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,四氯化碳購(gòu)自北京化工廠,水飛薊素膠囊來(lái)自德國(guó)馬博士大藥廠.

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠，體重18～22g，由北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施持續(xù)保持屏障環(huán)境標(biāo)準(zhǔn).主要控制溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度55%±5%，光照明∶暗 = 12h∶12h.動(dòng)物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)盒內(nèi)，每周兩次更換墊料和籠具，保持盒內(nèi)環(huán)境清潔干燥，每日添加飼料和飲水，保持動(dòng)物自由飲食活動(dòng).實(shí)驗(yàn)遵循中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物道德規(guī)范.

1.2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及指標(biāo)檢測(cè) 取雄性成年昆明小鼠54只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組.正常對(duì)照組不做任何處理，陰性對(duì)照組給予生理鹽水(20ml·kg-1·d-1,ig)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給藥水飛薊素(200mg·kg-1·d-1，ig)，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別灌胃770,1 540,3 080mg·kg-1·d-1的雞腿菇復(fù)合制劑.連續(xù)給藥10d后，除正常對(duì)照組外各組均灌胃CCl4的花生油溶液(1%，5mL·kg-1，ig)[5,6].禁食不禁水16h后，將小鼠摘除眼球取血，5 000r·min-1離心10min，取血清.按照試劑盒操作方法，檢測(cè)血清中GOT和GPT的水平.分離小鼠的肝臟，用冰生理鹽水制備肝臟勻漿(10%，w/v)，8 000r·min-1，4 ℃，離心10min，按照試劑盒操作方法，檢測(cè)血清中的MDA含量和SOD、GSH-PX活性.同時(shí)取肝臟左小葉組織，保存在10%中性福爾馬林溶液中，用于肝臟組織病理學(xué)檢查.

1.2.3肝臟組織病理學(xué)檢查上述固定的各組小鼠肝組織塊，系列乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片(4μm)，H&E染色，生物顯微鏡觀察.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)小鼠血清GOT和GPT活性的影響

與正常對(duì)照組相比，CCl4造模后的小鼠血清GOT、GPT水平明顯上升，與正常對(duì)照組相比均有極顯著的差異(P<0.01)，說明模型成功.與陰性對(duì)照組相比，灌胃低、中、高三個(gè)劑量的雞腿菇復(fù)合制劑均可明顯降低血清中GOT和GPT活力(P<0.05)，尤其是灌胃低劑量的雞腿菇復(fù)合制劑后，小鼠血清中的GOT、GPT活力有更明顯的降低趨勢(shì)(P<0.01)(表1).

表1　雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)小鼠血清GOT和GPT活性的影響

#P<0.05,##P<0.01；與正常對(duì)照組比較(compared with normal control);*P<0.05,**P<0.01與陰性對(duì)照組比較(compared with negative control)

2.2雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)小鼠肝臟MDA含量和SOD、GSH-PX活性的影響

與正常對(duì)照組相比，造模后的小鼠肝臟MDA水平明顯上升，差異極顯著(P<0.01)，灌胃低、中、高三個(gè)劑量的雞腿菇復(fù)合制劑均可降低肝臟MDA的水平(P<0.05).造模后小鼠肝臟中抗氧化酶SOD和GSH-PX水平與正常對(duì)照組相比明顯下降，差異極顯著(P<0.01)，低、中、高三個(gè)劑量的測(cè)試樣品均有提高SOD和GSH-PX水平的作用,尤其是低劑量組與模型組相比有顯著性差異(P<0.05,表2).

表2　雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)小鼠肝臟MDA含量和SOD、GSH-PX活性的影響

#P<0.05,##P<0.01；與正常對(duì)照組比較(compared with normal control);*P<0.05,**P<0.01與陰性對(duì)照組比較(compared with negative control)

2.3肝組織病理學(xué)變化

組織病理切片顯示,正常組的小鼠肝臟組織完好,肝細(xì)胞完整,形狀規(guī)則,排列緊密、均一,細(xì)胞核正常(圖1：A).陰性對(duì)照組小鼠肝臟嚴(yán)重受損,表現(xiàn)為大面積壞死區(qū)域和脂滴累積(圖1：B).陽(yáng)性藥物水飛薊素能明顯改善CCl4對(duì)肝細(xì)胞的毒害作用,使肝細(xì)胞基本恢復(fù)正常(圖1：C).雞腿菇復(fù)合制劑的低、中、高三個(gè)劑量均可減少肝臟受損害的程度，尤其是低劑量的效果更為明顯，基本無(wú)肝細(xì)胞脂肪變性和壞死(圖1：D～F),這說明雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠有較好的保護(hù)作用.

3討論

肝臟在維持人體健康中有著十分重要的地位.CCl4造成的肝損傷主要是因?yàn)槠浣?jīng)肝線粒體細(xì)胞色素P450作用后生成的三氯甲烷自由基可與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成障礙以及脂質(zhì)分解代謝紊亂，從而引起肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯累積.同時(shí)三氯甲烷自由基與O2結(jié)合生成的過氧化三氯甲烷自由基會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞無(wú)法正常代謝而死亡[3,5,7].

血清GOT和GPT活力水平是反應(yīng)肝損傷的靈敏指標(biāo)，其水平的高低與肝臟受損的程度一致[3].正常情況下，GOT和GPT主要存在于肝細(xì)胞中，血清內(nèi)含量很低，而當(dāng)肝細(xì)胞受到損害時(shí)，這些酶會(huì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)而進(jìn)入血循環(huán)中[8-10].本實(shí)驗(yàn)中CCl4造模后小鼠血清GOT、GPT活力水平明顯上升，與正常對(duì)照組相比均有極顯著的差異.而雞腿菇復(fù)合制劑在低、中、高三個(gè)劑量下都可以降低血清GOT和GPT活力水平，說明雞腿菇復(fù)合制劑具有保護(hù)肝臟的作用.

MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，常用作脂質(zhì)過氧化的指標(biāo).MDA能夠進(jìn)入膜脂的水相，與膜蛋白、膜磷脂上的-NH2交聯(lián)形成Schiff堿，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜變硬，流動(dòng)性減低，通透性增加，從

圖1　 雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響(×400)

A.正常對(duì)照組;B.陰性對(duì)照組;C.陽(yáng)性對(duì)照組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組

A.normal control group;B.negative control group;C.positive control group;D.low-dose group;E.middle-dose group;F.high-dose group.

而使膜的功能受損或降低，故而通過檢測(cè)其水平的高低可以反映機(jī)體氧化損傷的程度[2,3].SOD是生物體內(nèi)清除自由基、抑制自由基反應(yīng)的物質(zhì)之一，它可以催化超氧陰離子還原成過氧化氫和氧氣從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對(duì)機(jī)體細(xì)胞氧化損傷具有很強(qiáng)的防御功能[11,12].GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異的催化過氧化氫還原為水和氧氣，具有保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用，而在肝損傷發(fā)生的過程中，可以起到減輕肝細(xì)胞膜損害的作用[8,13].抗氧化酶SOD和GSH-PX組成了防止氧化損傷的第一道防線，其水平的高低直觀地反映了組織的氧化應(yīng)激能力[14].本實(shí)驗(yàn)中灌胃雞腿菇復(fù)合制劑可以拮抗CCl4造成的肝臟MDA水平的升高以及抗氧化酶SOD和GSH-PX活力水平的降低，同時(shí)結(jié)合組織病理學(xué)檢查結(jié)果可知，雞腿菇復(fù)合制劑對(duì)CCl4所致的急性肝損傷小鼠的肝臟具有明顯的保護(hù)作用，并且其保肝作用可能是通過增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，有效地拮抗CCl4所致的抗氧化酶活性降低，從而抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)[15,16].

4結(jié)論

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立了小鼠的CCl4急性肝損傷模型，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M轉(zhuǎn)氨酶和MDA水平明顯高于正常對(duì)照組，且抗氧化酶SOD和GSH-PX活力水平較正常對(duì)照組明顯降低也證實(shí)了模型的可信度.在本實(shí)驗(yàn)條件下，雞腿菇復(fù)合制劑尤其是在低劑量下可以降低血清轉(zhuǎn)氨酶及肝組織MDA的水平，同時(shí)提高抗氧化酶的水平，組織病理學(xué)檢查也顯示雞腿菇復(fù)合制劑可以明顯減輕CCl4對(duì)肝臟造成損害的程度，具有保護(hù)肝臟的作用.

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(責(zé)任編輯俞詩(shī)源)