直接法和浸提液法兩種不同方法對(duì)藥包材溶血率影響的研究

趙增琳，侯麗，喬春霞，林振華

(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局濟(jì)南藥品包裝材料檢驗(yàn)中心，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

摘要：目的采用直接法和浸提液法兩種檢查方法對(duì)藥品包裝材料進(jìn)行評(píng)價(jià)，比較兩種方法對(duì)藥包材檢測(cè)靈敏性的差異。方法選擇11種具有代表性的藥包材，分別采用直接法和浸提液法進(jìn)行溶血性能檢測(cè)，并對(duì)兩種方法測(cè)得的溶血結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果浸提液法溶血率大于直接法，均符合規(guī)定但不存在顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論直接法和浸提液法均可用于藥包材的溶血性能檢測(cè)，浸提液法作為藥包材溶血性能的一個(gè)探索，更符合臨床使用特點(diǎn)，建議全面考察藥包材溶血性能，增加浸提液評(píng)價(jià)方法。

關(guān)鍵詞：藥包材；溶血試驗(yàn)；直接法；浸提液法

作者簡(jiǎn)介：趙增琳，女，工程師，研究方向：醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)，E-mail:578216471@qq.com

通訊作者：侯麗，女，工程師，研究方向：醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)，Tel:15805317508,E-mail:521keren@sina.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.11文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Influence of direct contact method and extract method on the hemolytic effect

of drug packaging materials biomaterials

ZHAOZeng-lin,HOULi,QIAOChun-xia,LINZhen-hua

(StateFoodandDrugAdministrationJinanQualitySupervisionandInspectionCenterforPharmaceutical

PackagingMaterials，KeyLabofBiologicalEvaluationofMedicalDevicesof

ShandongProvince，Jinan250101，China)

Abstract：ObjectiveTo evaluate drug packaging materials by using two hemolysis methods,direct contact method and extract method.The two methods were compared in the sensitivity to detect drug packaging materials.Methods11 kinds of typical drug packaging materials were selected and their hemolytic properties were detected by direct contact method and extract method.The results of hemolysis in the two methods were compared.ResultsThe hemolysis rate of extract method was higher than the hemolysis rate of direct contact method.The hemolysis rate of two methods were both conformed to the regulations.Moreover,there was no significant difference of the direct contact method and extract method (P>0.05).ConclusionBoth of direct contact method and extract method can be used to the detection of drug packaging materials.It was an exploration that the extract method which was used to detect the hemolysis of drug packaging materials.This method was more consistent with the clinical characteristics.So the extract method should be added in the hemolytic test of drug packaging materials.

Key words:Drug Packaging materials;Hemolysis test;Direct contact method;Extract method

GB/T 16886.4 中指出溶血試驗(yàn)是一項(xiàng)很有意義的篩選試驗(yàn)[1]。溶血是指紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白的現(xiàn)象。引起溶血的原因有機(jī)械力如壓力和流變以及生物化學(xué)等方面的因素，溶血的發(fā)生在臨床上可能帶來(lái)一些不利影響，如可能導(dǎo)致肝臟和腎臟的嚴(yán)重?fù)p傷及血栓的形成，導(dǎo)致貧血并削弱載氧功能，對(duì)腦或其他器官產(chǎn)生繼發(fā)損害。一般用于評(píng)價(jià)紅細(xì)胞損傷的體外試驗(yàn)方法有直接法和浸提液法。直接法可測(cè)定由于物理和化學(xué)因素對(duì)紅細(xì)胞影響導(dǎo)致的溶血，浸提液法測(cè)定試驗(yàn)樣品浸提物導(dǎo)致的溶血[2]。

藥包材是指藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的藥品和醫(yī)療機(jī)構(gòu)配制的制劑所使用的直接接觸藥品的包裝材料和容器[3]。它在藥物的貯存過(guò)程中，直接或間接與藥物接觸，起著保護(hù)藥品的安全和有效，方便運(yùn)輸、貯存、銷(xiāo)售和使用等重要作用。但其可能會(huì)通過(guò)吸附、吸收、滲透和抽提等方式與藥物發(fā)生相互反應(yīng)。為保障公眾用藥安全，應(yīng)加強(qiáng)藥品包裝材料的質(zhì)量控制，要求其具備良好的生物安全性[4,5]。

目前，藥包材標(biāo)準(zhǔn)YBB00032003溶血檢查法中僅制定了直接接觸一種方法對(duì)其溶血性進(jìn)行評(píng)價(jià)，本文對(duì)搜集的11批藥包材進(jìn)行直接接觸和浸提液兩種溶血方法的比較，其目的是研究直接法和浸提液法兩種溶血檢查方法對(duì)藥品包裝材料進(jìn)行的評(píng)價(jià)，比較兩種方法對(duì)藥包材檢測(cè)靈敏性的差異。

1儀器、試劑及材料

1.1儀器SIGMA 3-15離心機(jī)；DZKW-C型電熱恒溫水浴鍋；U-3900H紫外分光光度計(jì)。

1.2試劑及材料0.9%氯化鈉注射液(山東辰欣藥業(yè)股份有限公司)；蒸餾水；注射用冷凍干燥用溴化丁基橡膠塞(湖北華強(qiáng)科技有限責(zé)任公司，規(guī)格型號(hào)：26-Bb)；氯化丁基橡膠塞(湖北華強(qiáng)科技有限責(zé)任公司，規(guī)格型號(hào)：20-A)；注射用無(wú)菌粉末用溴化丁基橡膠活塞(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：20-A)；注射液用溴化丁基橡膠活塞(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：28-B-1)；筆式注射器用氯化丁基橡膠活塞(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：1 mL長(zhǎng)/72 G 硬)；預(yù)灌封玻璃針管(帶護(hù)帽)(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：YZINCH-2)；預(yù)灌封注射器用聚異戊二烯橡膠針頭護(hù)帽(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：Y1mL細(xì)長(zhǎng))；預(yù)灌封注射器氯化丁基橡膠活塞[山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：0.4*18.7 RWLR(正常壁)]；筆式注射器用溴化丁基橡膠墊片(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：3MLA-4)；筆式注射器用溴化丁基橡膠活塞(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：B3mL-GL)；藥用合成聚異戊二烯墊片(山東省藥用玻璃股份有限公司，規(guī)格型號(hào)：20B2)。

2方法和結(jié)果

2.1方法

2.1.1新鮮稀釋兔血制備取新鮮抗凝兔血8 mL，加0.9%氯化鈉注射液10 mL稀釋。

2.1.2直接法試驗(yàn)組一：取完整供試樣品每管加入5 g，再加入0.9%氯化鈉注射液10 mL[6]。

試驗(yàn)組二：參照GB/T16886.12標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)生物學(xué)試驗(yàn)浸提液制備的方法，將選取1.25 cm2·mL-1的浸提比例將試樣品投入浸提介質(zhì)(0.9%氯化鈉注射液)中(膠塞類(lèi)完整投入)，另取陰性對(duì)照組每管加入0.9%氯化鈉注射液10 mL；陽(yáng)性對(duì)照組每管加入蒸餾水10 mL。以上每組平行操作3 管。

將全部試管置37 ℃恒溫水浴中保溫30 min，每支試管加入0.2 mL 稀釋兔血，輕輕混勻，置37 ℃恒溫水浴中繼續(xù)保溫60 min。倒出管內(nèi)液體離心5 min。吸取上清液移入比色皿內(nèi)，用U-3900H紫外分光光度計(jì)在545 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，3個(gè)平行樣吸光度值的平均值為其吸光度值。陰性對(duì)照的吸光度值不應(yīng)大于0.03，陽(yáng)性對(duì)照的吸光度值應(yīng)為(0.80±0.3)，并計(jì)算溶血率[7]。

2.1.3浸提液法參照GB/T16886.12標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)生物學(xué)試驗(yàn)浸提液制備的方法[8]，將試樣品投入浸提介質(zhì)(0.9%氯化鈉注射液)中(膠塞類(lèi)完整投入)，選取1.25 cm2·mL-1的浸提比例，在(121±1)℃條件下浸提(1±0.1)h制備供試液。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照同條件下進(jìn)行試驗(yàn)。取浸提液和對(duì)照液各10 mL，以下步驟同直接接觸法。

溶血率的計(jì)算公式如下:

若溶血率<5%，則說(shuō)明材料符合醫(yī)用材料的溶血試驗(yàn)要求。

2.2結(jié)果直接法和浸提液法兩種方法對(duì)供試品的溶血試驗(yàn)吸光度平均值見(jiàn)表1，溶血率結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　溶血試驗(yàn)的吸光度平均值

表2　溶血試驗(yàn)結(jié)果

表1、表2顯示，直接接觸法中試驗(yàn)組一的結(jié)果和試驗(yàn)組二的結(jié)果之間不存在差異(P>0.05)，浸提液法溶血率結(jié)果大于直接法溶血率結(jié)果，兩種不同接觸方法對(duì)藥包材溶血試驗(yàn)溶血率檢查結(jié)果均符合規(guī)定，而且兩種方法之間不存在差異(P>0.05)。直接接觸法的溶血率和浸提液法溶血率比較，數(shù)值相對(duì)較小，偶爾出現(xiàn)相反結(jié)果(9號(hào)產(chǎn)品)，也在規(guī)定范圍內(nèi)，而且絕對(duì)值比較小，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

血液相容性評(píng)價(jià)是所有用于與血液直接/間接接觸的醫(yī)療器械和生物材料在臨床應(yīng)用前所必須進(jìn)行的一項(xiàng)工作，在眾多的血液相容性試驗(yàn)中，溶血試驗(yàn)是國(guó)內(nèi)外各實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展比較多的一項(xiàng)試驗(yàn)。溶血試驗(yàn)適用于材料的體外急性溶血性能評(píng)價(jià)。材料和血液接觸時(shí)，其溶血成分的存在可導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，血紅蛋白釋放，從而使游離血漿血紅蛋白增加，產(chǎn)生對(duì)機(jī)體的毒副作用。通過(guò)材料或其溶出物與血液接觸可檢測(cè)材料的可溶性或釋放性成分的溶血性能及材料表面的溶血性能。

藥品包裝的材料，尤其是直接接觸藥液的包裝材料，對(duì)保證藥品穩(wěn)定性起決定性作用。由于藥包材與藥品的接觸時(shí)間可能長(zhǎng)達(dá)整個(gè)藥品的有效期，因此應(yīng)加大對(duì)藥包材溶血性的重視[9]。以往對(duì)于藥包材生物材料的溶血性能評(píng)價(jià)基本上依據(jù)YBB系列標(biāo)準(zhǔn)中推薦的方法，這種直接接觸法主要是對(duì)由紅細(xì)胞與樣品之間物理和化學(xué)相互作用所導(dǎo)致的溶血現(xiàn)象的評(píng)價(jià),能夠比較直觀的模擬材料的最終應(yīng)用狀態(tài)，適用于與藥品短時(shí)間接觸的被測(cè)樣品。對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間與藥品接觸的藥包材，其材料中存在某些低分子可溶性物質(zhì)的溶出過(guò)程可能比較緩慢，因此在直接接觸法中材料與介質(zhì)的接觸時(shí)間并不能很好的體現(xiàn)樣品的實(shí)際臨床應(yīng)用過(guò)程。而浸提液法則是能夠客觀評(píng)價(jià)樣品中可溶出成分引起的溶血現(xiàn)象，浸提法的浸提時(shí)間可根據(jù)材料的不同特性加以延長(zhǎng)，從而有效避免了因化學(xué)因素、物理因素及樣品的形狀等表面物理形狀原因所導(dǎo)致的溶血現(xiàn)象發(fā)生。

本研究選用了11種藥包材生物材料，參照GB/T16886.12標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)生物學(xué)試驗(yàn)浸提液制備的方法中浸提比例的選擇，對(duì)于厚度大于1.0 mm的材料易選取1.25 cm2·mL-1的比例，所以本研究中直接接觸法和浸提液法兩種方法下都選取了1.25 cm2·mL-1的比例做比較。從溶血試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，直接接觸法兩種比例下的溶血率結(jié)果無(wú)顯著性差異，均很低或等于零，說(shuō)明不同濃度的材料直接接觸血液后對(duì)血細(xì)胞的損傷程度較低，而浸提液法在121 ℃條件下所得的溶血率相對(duì)高于直接接觸法結(jié)果，結(jié)果均符合藥包材生物材料溶血試驗(yàn)要求，但溶血率之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明這11種藥包材生物材料在121 ℃條件下浸提液法作用下對(duì)紅細(xì)胞有影響的可溶性成分的溶出大于直接接觸法，但并不明顯。由于本研究只選用11種材料，而且在浸提溫度的選擇上只選取了121 ℃這一種條件，對(duì)于其他溫度條件下的溶血率結(jié)果不能全面評(píng)估。所得試驗(yàn)結(jié)果是否對(duì)各種藥包材生物材料都具有代表性還有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究比較了藥包材在直接接觸法與浸提液法對(duì)溶血率的影響，該研究工作在國(guó)內(nèi)外還未曾見(jiàn)有報(bào)道，所以，從某種意義上講，浸提法作為一種現(xiàn)行直接接觸法的補(bǔ)充試驗(yàn)，是對(duì)溶血試驗(yàn)作為檢測(cè)藥包材生物材料溶血性能的一個(gè)探索，更符合臨床應(yīng)用特點(diǎn)。對(duì)一種未知的生物材料來(lái)說(shuō)，最好進(jìn)行直接接觸法和浸提法兩種不同方法的比較，為評(píng)價(jià)醫(yī)療器械和生物材料臨床應(yīng)用的安全性提供一種新的科學(xué)手段。

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