苦瓜子有效成分RNA酶MC2抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用分析

黃炬輝

?實(shí)驗(yàn)研究?

苦瓜子有效成分RNA酶MC2抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用分析

黃炬輝

目的 對(duì)苦瓜子有效成分RNA酶(RNase)MC2抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用和機(jī)制進(jìn)行分析和探討。方法 通過(guò)克隆形成和MTT對(duì)肝癌細(xì)胞增殖受到的RNase MC2的影響進(jìn)行分析；選擇流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)肝癌細(xì)胞周期受到的RNase MC2的影響進(jìn)行檢測(cè)；選擇電鏡對(duì)細(xì)胞自噬受到的RNase MC2的誘導(dǎo)作用進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 RNase MC2會(huì)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖起到顯著的抑制作用；通過(guò)對(duì)p21和p53蛋白表達(dá)進(jìn)行上調(diào)能夠?qū)е翯2/M期阻滯；通過(guò)LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)的增加能夠?qū)?xì)胞自噬起到誘導(dǎo)作用。結(jié)論 RNase MC2通過(guò)對(duì)p21的上調(diào)能夠?qū)2/ M 期阻滯起到誘導(dǎo)作用,通過(guò)對(duì)Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)?xì)胞自噬起到誘導(dǎo)作用,從而對(duì)肝癌細(xì)胞中的增殖起到顯著的抑制作用。

RNA酶MC2；肝癌細(xì)胞；抑制

在全球范圍內(nèi)肝癌細(xì)胞都屬于一種常見(jiàn)的惡性細(xì)胞,因此肝癌細(xì)胞治療技術(shù)的進(jìn)展受到了人們的普遍關(guān)注。肝癌細(xì)胞的抗藥性非常強(qiáng),其具有很高的死亡率?，F(xiàn)階段肝癌細(xì)胞的治療技術(shù)仍然沒(méi)有實(shí)現(xiàn)突破性進(jìn)展,大量的研究表明［1］,治療肝癌細(xì)胞的一個(gè)非常重要的途徑就是提取中草藥中的有效成分,對(duì)其中的抗腫瘤藥物進(jìn)行篩選。作為一種核糖核酸酶,RNase C2屬于一種飲食苦瓜子提取物,其能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用。本文對(duì)苦瓜子有效成分RNase MC2抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用和機(jī)制進(jìn)行了分析和探討,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)購(gòu)買(mǎi)el-7402和QGY-7703人類肝癌細(xì)胞株,由本院提供RNase MC2,通過(guò)純水溶解RNase MC2,使其成為5.0mmol/L儲(chǔ)存液的形式。

1.2 方法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)el-7402(為對(duì)照)和QGY-7703人類肝癌細(xì)胞株,具體培養(yǎng)條件為：選

擇10%胎牛血清的DMEM作為培養(yǎng)基；溫度為37℃；濕度為95%；CO2濃度為5%［2］。②通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。在96孔板中對(duì)8000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行24 h的培養(yǎng),隨后將濃度分別為20、5、1 μmol/L的RNase MC2加入進(jìn)去,進(jìn)行48 h的孵育。將100ml的MTT溶液分別加入到每孔中,使其持續(xù)2.5 h的作用［3］。在將上清液去除掉后,將100ml的二甲亞砜(DMSO)溶液加入,利用分光光度計(jì)對(duì)充分溶解后的晶體進(jìn)行讀取。③克隆形成實(shí)驗(yàn)：在6孔板中對(duì)100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),隨后在5.0 μmol/L RNase MC2的培養(yǎng)基中將其加入。選擇0.05%結(jié)晶紫對(duì)其進(jìn)行5min的染色,對(duì)集落數(shù)量進(jìn)行計(jì)算［4］。④細(xì)胞周期檢測(cè)：在細(xì)胞受RNase MC2作用不同時(shí)間后,通過(guò)70%的乙醇將其固定在4℃冰箱中過(guò)夜,將磷酸鹽緩沖溶液(PBS)加入,在黑暗中對(duì)其進(jìn)行30min的放置。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNase MC2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用 濃度在2.5 μmol/L以上的RNase MC2能夠使肝癌細(xì)胞活性為60%以下,對(duì)肝癌細(xì)胞的活性起到顯著的抑制作用,2.5 μmol/L以下的RNase MC則具有抑制80%以上的肝癌細(xì)胞活性, 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。克隆形成結(jié)果顯示,RNase MC2能夠使肝癌細(xì)胞的克隆形成能力出現(xiàn)明顯下降。

2.2 RNase MC2對(duì)G2/M期阻滯的誘導(dǎo)作用 通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,肝癌細(xì)胞在受到RNase MC2作用的24 h之后,其出現(xiàn)了G2/M期阻滯。如其中的2.5 μmol/L,Bel-7402在G2/M期達(dá)到了(36.95±5.26)%的細(xì)胞百分比,QGY-7703在G2/M期達(dá)到了(30.25±3.72)%的細(xì)胞百分比；對(duì)照細(xì)胞則分別達(dá)到了(23.50±3.63)%和(17.74±4.62)%的細(xì)胞數(shù)量百分比,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 RNase MC2對(duì)肝癌細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用 通過(guò)四甲吖啶進(jìn)行染色,對(duì)RNase MC2產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡的誘導(dǎo)作用進(jìn)行進(jìn)一步觀察。結(jié)果顯示,肝癌細(xì)胞在經(jīng)過(guò)RNase MC2處理后出現(xiàn)了明顯增多的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡數(shù)量。電鏡結(jié)果顯示,肝癌細(xì)胞在經(jīng)過(guò)RNase MC2處理后形成了多個(gè)自噬小體。此外,上調(diào)的LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)對(duì)發(fā)生細(xì)胞自噬具有提示作用。

3 討論

通過(guò)中藥能夠使化療藥物的副作用得以有效減輕,使腫瘤患者的生活質(zhì)量得以改善,并且增加腫瘤患者的生存期。所以提取中藥中的有效成分,使其對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行對(duì)抗,是突破肝癌細(xì)胞治療瓶頸的一種非常重要的方式［6］。本次研究發(fā)現(xiàn),RNase MC2作為苦瓜子的有效提取成分,可以對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖起到顯著地抑制作用,RNase MC2通過(guò)對(duì)p21的上調(diào)能夠?qū)2/ M期阻滯起到誘導(dǎo)作用,通過(guò)對(duì)Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)?xì)胞自噬起到誘導(dǎo)作用,其主要是對(duì)肝癌細(xì)胞中的Bel-7402和QGY-7703的表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo),從而進(jìn)一步誘發(fā)出現(xiàn)G2/ M 期阻滯。

在病理狀態(tài)細(xì)胞和正常細(xì)胞中自噬屬于一種普遍存在的生理機(jī)制,在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中自噬具有十分重要的作用,特別是在癌細(xì)胞中作為細(xì)胞代謝壓力的適應(yīng)性反應(yīng)自噬發(fā)揮了十分重要的作用［7］。本次研究表現(xiàn),RNase MC2通過(guò)對(duì)Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)?xì)胞自噬起到誘導(dǎo)作用。但是目前尚未清楚在RNase MC2誘發(fā)細(xì)胞死亡中自噬的作用機(jī)制,仍然需要對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行更深一步的研究［8］。

綜上所述,本次研究顯示RNase MC2通過(guò)對(duì)p21的上調(diào)能夠?qū)2/ M 期阻滯起到誘導(dǎo)作用,通過(guò)對(duì)Beclin-1的上調(diào)能夠?qū)?xì)胞自噬起到誘導(dǎo)作用,從而對(duì)肝癌細(xì)胞中的增殖起到顯著地抑制作用。因此表明,RNase MC2作為苦瓜子的有效提取成分,屬于一種具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的抗腫瘤藥物。

［1］蔡濱,許陽(yáng)賢,蔣海濤,等.益氣養(yǎng)陰中藥聯(lián)合FOLFOX4方案化療對(duì)大腸癌術(shù)后患者免疫功能的影響.腫瘤防治研究,2014,41(8):932-935.

［2］王婭杰,李琦,李玉潔,等.中藥在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中的作用及研究現(xiàn)狀.中國(guó)中藥雜志,2014,39(24):4693-4698.

［3］黃賢生,王仁,馬小峰,等.苦瓜蛋白通過(guò)阻止核因子κB核轉(zhuǎn)位抑制炎性因子生成.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2013,21(7):583-588.

［4］湯琴,鄧媛元,張雁,等.苦瓜對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用及其活性成分研究進(jìn)展.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,41(13):104-109.

［5］于浩,周永剛,王友群.索拉菲尼治療腎細(xì)胞癌療效及安全性的Meta分析.中國(guó)藥學(xué)雜志,2014(5):427-430.

［6］董安康,王旭穎,趙偉.細(xì)胞毒性RNase及其抗腫瘤活性.生命的化學(xué),2010(5):734-739.

［7］段振玲,彭芝蘭,王贊宏.自噬基因Beclin1對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長(zhǎng)的抑制作用.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(4): 672-676.

［8］李湘竑,鐘克波,劉延,等.索拉菲尼治療肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)患者的療效及安全性分析.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011(9): 1608-1610.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.11.203

2016-03-09］

511483 廣州市番禺區(qū)沙灣人民醫(yī)院