董亞青　朱文斗　王琳琳等

摘要：選擇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，根據(jù)酵母密碼子偏愛(ài)性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，連接至載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-α，將重組載體酶切線性后克隆至畢赤酵母GS115，篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子及其甲醇利用型，對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：雞α-干擾素在畢赤酵母中成功表達(dá)，在含2%酸水解酪蛋白，經(jīng)0.5%甲醇在28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)72 h后，重組蛋白表達(dá)量最多，抗病毒活性最高。

關(guān)鍵詞：雞；α-干擾素；畢赤酵母；基因表達(dá)；表達(dá)條件

中圖分類號(hào)： S858.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0275-03

收稿日期：2014-11-27

基金項(xiàng)目：江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2014380）；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院2014年度重點(diǎn)支持項(xiàng)目（編號(hào)：NSFZD1405）；揚(yáng)州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司橫向合作課題（編號(hào)：00010114012）。

作者簡(jiǎn)介：董亞青（1980—），女，江蘇興化人，碩士，講師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail： 156815306@qq.com。

通信作者：王永娟，博士，副教授，主要從事生物工程技術(shù)研究。E-mail：43088591@qq.com。干擾素（IFN）是1種具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等作用的細(xì)胞因子，由英國(guó)科學(xué)家Isaacs和Lindemann于1957年首次發(fā)現(xiàn)[1]。Lamp等于1963年純化了這種細(xì)胞因子，并證明其為蛋白質(zhì)[2]。干擾素具有一定的特異性，只有同種的生物細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素才能起到保護(hù)作用，對(duì)異種生物細(xì)胞則無(wú)作用[3]。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源、生化特性及生物學(xué)活性可將其分為兩大類：Ⅰ類、Ⅱ類[4]。雞α-干擾素（ChIFN-α）全基因?yàn)?82個(gè)堿基，編碼193個(gè)氨基酸，包含31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、162個(gè)氨基酸的成熟蛋白[5]。ChIFN-α屬于Ⅰ類干擾素，是禽類主要干擾素，具有抑制病毒復(fù)制、加強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷力的能力[6]。本試驗(yàn)根據(jù)酵母密碼子偏愛(ài)性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，克隆至畢赤酵母分泌表達(dá)型載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-α，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，篩選并鑒定其甲醇利用型，優(yōu)化其表達(dá)條件，以期獲得表達(dá)量多、抗病毒活性高的重組蛋白，旨在為干擾素應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

ChIFN-α序列合成由生工生物工程上海（股份）有限公司完成；畢赤酵母GS115由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶、連接酶、Preatained Protein 分子量marker均購(gòu)自Fermentas公司；Wizard DNA Clean-up System均購(gòu)自美國(guó)Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、培養(yǎng)基等均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2重組質(zhì)粒pPIC9K-α的構(gòu)建

根據(jù)酵母密碼子偏愛(ài)性合成ChIFN-α成熟肽的基因序列，在其末端加入設(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)酶切、連接將ChIFN-α的基因序列克隆至畢赤酵母分泌表達(dá)型載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.3重組質(zhì)粒pPIC9K-α的轉(zhuǎn)化及篩選

制備畢赤酵母感受態(tài)，-70℃保存。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pPIC9K-α大量制備并純化，經(jīng)SalⅠ 酶切線性并純化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化菌涂布于不含組氨酸的MD瓊脂平板上，30℃孵育3 d。用含不同濃度G418的YPD平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。用MD、MM平板鑒定其甲醇利用型，通常在MD平板上生長(zhǎng)快且MM平板上生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)的為Muts，生長(zhǎng)速度一樣的為Mut+。

1.4重組質(zhì)粒pPIC9K-α的表達(dá)及抗病毒試驗(yàn)

挑取生長(zhǎng)于YPD平板上的單菌落，接種于BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h左右，至D600 nm值為2～6，3 000 g離心3 min，收集菌體沉淀，懸浮于含甲醇的BMMY液體培養(yǎng)基中，至D600 nm值約為1，30 ℃ 230 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5%，96 h后收獲培養(yǎng)液，3 000 g離心5 min，收集上清。在雞胚成纖維細(xì)胞-水皰性口炎病毒（CEF-VSV）系統(tǒng)中檢測(cè)重組ChIFN-α的抗病毒活性，在生長(zhǎng)正常的CEF中，分別加入重組的ChIFN-α、病毒和重組ChIFN-α、病毒，培養(yǎng)約36 h，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.5ChIFN-α成熟肽表達(dá)條件的優(yōu)化

挑取生長(zhǎng)于YPD平板上的高拷貝重組菌的單菌落，接種于BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600 nm值為2～6，3 000 g離心3 min，收集菌體沉淀，懸浮于含0.5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基中，至D600 nm值約為1，分別從第1天起每隔1 d取發(fā)酵液上清進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)。挑取高拷貝重組菌單菌落，同上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)溫度分別設(shè)定為20、22、24、26、28、30 ℃，取誘導(dǎo)后72 h培養(yǎng)上清測(cè)其抗病毒活性。挑取高拷貝重組菌單菌落，同上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%，取誘導(dǎo)后72 h培養(yǎng)上清測(cè)其抗病毒活性。在培養(yǎng)基中加入酸水解酪蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)性底物，酸水解酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為1%、2%、3%，誘導(dǎo)表達(dá)方法同上。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pPIC9K-α的構(gòu)建

將連接有ChIFN-α基因的pPIC9K轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑去陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ、SnalBⅠ進(jìn)行雙酶切，顯示結(jié)果正確（圖1）。

2.2重組質(zhì)粒pPIC9K-α的轉(zhuǎn)化及篩選

將重組質(zhì)粒pPIC9K-α電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，將MD瓊脂平板上的陽(yáng)性克隆用含不同質(zhì)量濃度G418的YPD平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，獲得4株抗4 mg/mL G418的高拷貝轉(zhuǎn)化子及5株抗3 mg/mL G418的高拷貝轉(zhuǎn)化子。用MD、MM平板鑒定其甲醇利用型，結(jié)果顯示均為Mut+。

2.3重組質(zhì)粒pPIC9K-α的表達(dá)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)

接毒約36 h后，正常生長(zhǎng)的GEFs基本未出現(xiàn)病變（圖2-1），加入了重組ChIFN-α的正常生長(zhǎng)的CEFs情況更加良好（圖2-2），加入了病毒和重組ChIFN-α的細(xì)胞（圖2-3）與只加病毒組細(xì)胞（圖2-4） 相比， 細(xì)胞殘缺程度明顯較輕。4mg/mLG418抗性的重組酵母菌株的表達(dá)水平

與3 mg/mL G418抗性重組酵母菌株相當(dāng)，不存在拷貝數(shù)依賴性。

2.4ChIFN-α成熟肽表達(dá)條件的優(yōu)化

誘導(dǎo)24 h所得的抗病毒效果不明顯，1～3 d重組蛋白的活性增強(qiáng)，3 d后活性有所下降（圖3）。不同溫度誘導(dǎo) 3 d 后，28 ℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，重組蛋白的活性最高（圖4）。不同甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白活性最高（圖5）。在培養(yǎng)基中加入酸水解酪蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)性底物時(shí)，當(dāng)酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，重組蛋白活性最強(qiáng)（圖6）。

綜上所述，重組蛋白ChIFN-α最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：在含2%酸水解酪蛋白、經(jīng)0.5%甲醇28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3 d后，重組蛋白表達(dá)量最多，抗病毒活性最高。

3結(jié)論與討論

我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)規(guī)模及總量均居世界首位[7]，但禽病仍然阻礙養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一些禽病的治療及預(yù)防缺乏有效手段。因此，尋求安全、高效的治療制

劑和預(yù)防制劑迫在眉睫。干擾素是多功能的糖蛋白，與免疫球蛋白不同，它不具有免疫球蛋白的抗體特異性，但其具備廣譜的抗病毒活性及強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用[8-10]，對(duì)防治禽病具有重要意義。由于天然的干擾素在機(jī)體內(nèi)表達(dá)量甚微，無(wú)法滿足臨床需要，因此人們利用基因工程技術(shù)來(lái)研究開(kāi)發(fā)高效生產(chǎn)干擾素，用于防治病毒性疾病[11]。本研究利用畢赤酵母表達(dá)體系表達(dá)制備了ChIFN-α，構(gòu)建了畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K-α，獲得了高拷貝重組酵母菌株，對(duì)重組酵母菌進(jìn)行誘導(dǎo)，使重組蛋白獲得了較高水平表達(dá)，且具有良好的抗病毒活性，解決了原核表達(dá)系統(tǒng)抗菌肽生產(chǎn)過(guò)程中普遍存在的表達(dá)量低、活性低、成本高等問(wèn)題，為禽病防治奠定了良好的基礎(chǔ)。

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