尹柏雙　王秋竹++付連軍等

摘要：為研究奶牛隱性乳房炎發(fā)病程度與乳清中結(jié)合珠蛋白（HP）含量變化的關系，選取6頭健康奶牛和18頭患輕、中、重度隱性乳房炎奶牛為試驗動物，采集乳樣、分離乳清，利用HP ELISA檢測試劑盒測定樣品中HP含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著隱性乳房炎病情加重、乳汁體細胞數(shù)的增加，乳清中HP含量逐漸升高，與健康對照組比較升高極顯著（P<0.01）。結(jié)果表明，乳清中HP含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關性，乳腺損傷程度和乳汁體細胞數(shù)與乳清中HP含量呈正相關。

關鍵詞：隱性乳房炎；奶牛；乳清；結(jié)合珠蛋白

中圖分類號： S858.232+.6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0289-02

收稿日期：2014-11-10

基金項目：吉林省科技廳重點科技攻關項目（編號：20130206040NY）；吉林省教育廳“十二五”科學技術項目（編號：吉教科合字2013339）；吉林市科技局杰出青年培育專項（編號：2013625019）；吉林農(nóng)業(yè)科技學院重點學科培育項目（編號：吉農(nóng)科合字2013X021）。

作者簡介：尹柏雙（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，從事奶牛乳腺疾病方向的研究工作。E-mail：ybs3421@126.com。奶牛乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的疾病之一，其中隱性乳房炎發(fā)生率最高。隱性乳房炎可引起泌乳奶牛產(chǎn)奶量下降、牛奶品質(zhì)降低、養(yǎng)殖成本增加、產(chǎn)后發(fā)情延長、妊娠時間推遲，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[1]。結(jié)合珠蛋白（HP）是血清α2球蛋白組中的一種酸性糖蛋白，在哺乳動物血液和其他體液中廣泛分布，具有結(jié)合炎癥疾病標記物、游離血紅蛋白、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等主要功能[2-6]。Grnlund等研究表明，在金黃色葡萄球菌引起奶牛乳房炎的急性期，血清結(jié)合珠蛋白的表達量增加[7]。楊永新等研究表明，臨床型乳房炎奶牛乳汁中結(jié)合珠蛋白表達量顯著增加[8]。本試驗研究乳清中結(jié)合珠蛋白表達量與不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病的關系，以期為隱性乳房炎判定提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物

通過乳汁體細胞計數(shù)監(jiān)測后選擇年齡、胎次、產(chǎn)奶量、泌乳期等指標相近的健康奶牛6頭和患不同程度奶牛隱性乳房炎奶牛18頭，由吉林市某奶牛場提供。

1.2主要試劑與儀器

結(jié)合珠蛋白（HP）含量測定用HP ELISA試劑盒，購于南京建成生物試劑研究所；主要儀器有Fossmatic 5000體細胞計數(shù)儀（FOSS公司，丹麥）、Varioskan酶標儀（Thermo公司，美國）、離心機（Sigma公司，美國）。

1.3試驗動物分組

通過乳汁體細胞計數(shù)監(jiān)測后將試驗奶牛分成健康對照組[6頭，體細胞數(shù)量（SCC）<10×104 個/mL]、輕度隱性乳房炎組（6頭，50×104 個/mL500×104 個/mL）。

1.4乳樣采集

采集試驗奶牛的乳汁，采樣前對乳區(qū)進行清洗，然后用70%乙醇消毒乳區(qū)，棄掉前3 把乳汁，分別采10 mL乳裝入無菌試管中，將采集的乳樣放到冰盒中，帶回實驗室檢測。

1.5乳清制備

將采集的乳樣于3 000 r/min離心5 min，除去上層乳脂，然后于16 000 r/min高速離心機中離心10 min，去除沉淀，保留上清，4 ℃條件下保存、待測。

1.6檢測方法

乳汁體細胞計數(shù)采用體細胞計數(shù)儀測定；HP含量采用HP ELISA試劑盒測定，在酶標儀上比色測定D450 nm吸光值，根據(jù)試劑盒說明繪制標準曲線后計算HP含量。

1.7數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)作單因素方差分析，結(jié)果以“均值±標準差”表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1乳清中結(jié)合珠蛋白標準曲線及回歸方程

通過ELISA HP檢測試劑盒檢測5個濃度梯度的HP標樣的 D450 nm，利用ELISA Calc回歸/擬合軟件進行分析。以HP濃度為自變量X（μg/mL）、D450 nm為因變量Y，擬合直線回歸方程為：y=0.069 54x+0.144 46，r2=0.998 51，濃度與吸光度線性回歸良好，表明該方法檢測樣品值可信度較高（圖1）。

2.2乳清中結(jié)合珠蛋白檢測結(jié)果

由表1可知，患輕度乳房炎奶牛乳清中HP含量為74111 μg/mL，極顯著高于健康對照組；同樣，患中、重度乳房炎奶牛乳清中HP含量也極顯著高于健康對照組。此外，隨著乳房炎病情加重、乳汁體細胞數(shù)增加，乳清中HP含量逐漸升高，表明乳腺損傷程度和乳汁體細胞數(shù)與乳清中HP含量呈正相關。

表1奶牛乳清中C-反應蛋白含量

組別樣品數(shù)量（個）HP含量（μg/mL）健康對照組632.573±4.947輕度乳房炎組674.111±10.357**中度乳房炎組677.093±4.394**重度乳房炎組686.146±8.521**注：“**”表示與對照組比較差異極顯著（P<0.01）。

3討論

結(jié)合珠蛋白主要由肝臟合成，參與機體的免疫應答，屬急性期反應蛋白，其表達受細胞因子和前列腺素（PG）等不同因素的調(diào)節(jié)，炎癥、創(chuàng)傷和感染等病理狀態(tài)也會影響血液HP含量的變化[9]。Khoshvaghpi等研究患有外科感染、急性子宮炎奶牛血清和牛奶中HP變化結(jié)果表明，血清和牛奶中HP濃度均高于健康奶牛[10]。楊永新等研究結(jié)果表明，大腸桿菌性乳房炎奶牛血漿中結(jié)合珠蛋白表達量顯著高于健康奶牛[11]；試驗誘導或自然發(fā)生的大腸桿菌乳房炎奶牛血清中結(jié)合珠蛋白的濃度增加[12-13]；患輕度乳房炎奶牛血清和牛奶中HP含量均升高[14]；陳國燦等檢測自然感染隱性乳房炎奶牛乳汁中的結(jié)合珠蛋白濃度結(jié)果表明，奶?；茧[性乳房炎時，其肝臟合成的HP增加，導致乳汁中HP含量也增加[15]；Grnlund等報道，患金黃色葡萄球菌性乳房炎的奶牛，在急性期時乳汁和血清中HP含量迅速升高[7，16]。本試驗結(jié)果表明，與健康對照組相比，患隱性乳房炎奶牛乳清中HP含量極顯著升高，隨著隱性乳房炎病情加劇，乳汁中HP含量逐漸升高，這與以往研究結(jié)果基本一致。在臨床獸醫(yī)學領域針對我國奶牛隱性乳房癌高發(fā)病率和診斷技術相對落后的情況下，利用乳清中HP含量變化的特點，開展早期快速診斷將具有廣闊的研究空間和發(fā)展前景。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，乳清中HP含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關性，隨著乳腺損傷程度和乳汁體細胞數(shù)增加，乳清中HP含量顯著升高。

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