分子印跡濾過型凈化柱凈化/分子熒光光譜法測定花生根中白藜蘆醇

丘秀珍，彭翠紅，王少玲，郭會時，盧呂泉

(韶關(guān)學(xué)院　化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東　韶關(guān)　512005)

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分子印跡濾過型凈化柱凈化/分子熒光光譜法測定花生根中白藜蘆醇

丘秀珍*，彭翠紅，王少玲，郭會時，盧呂泉

(韶關(guān)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005)

分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology，MIT)是將待分離的目標(biāo)分子與功能單體通過共價或非共價作用進(jìn)行預(yù)組裝，與交聯(lián)劑共聚制備得到聚合物。除去目標(biāo)分子后，分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)中形成與目標(biāo)分子空間互補(bǔ)并具有預(yù)定的多重作用位點的“空穴”，對目標(biāo)分子的空間結(jié)構(gòu)具有“記憶”效應(yīng)，能夠高選擇性識別復(fù)雜樣品中的印跡分子。由于MIPs 可特異性結(jié)合模板分子，兼具生物識別體系和化學(xué)識別體系的優(yōu)點，可選擇性識別富集復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物，因此被廣泛用于固相萃取[1-4]、固相微萃取[5-6]、基質(zhì)固相分散萃取[7]、攪拌棒固相萃取[8-9]等樣品前處理技術(shù)。

圖1　濾過型凈化柱示意圖Fig.1　Schematic diagram of an m-PFC tip

白藜蘆醇( Resveratrol,RES )又稱為芪三酚，主要存在于葡萄、虎杖、桑葚、花生植株及其他植物提取物中，是植物在環(huán)境惡劣或遭到有害物質(zhì)侵害時自身排泄的一種可抵抗霉菌傳染的抗毒素，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、保護(hù)肝臟和心血管等功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等方面[10]。目前，白藜蘆醇的檢測方法主要有化學(xué)發(fā)光法[11]、熒光光譜法[12]、高效液相色譜法[13-15]及定量核磁共振波譜法[16]等。

將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于白藜蘆醇的檢測雖已見報道[17-19]，但仍處于起步階段。本研究采用β-環(huán)糊精(β-CD)和甲基丙烯酸(MAA)雙功能單體[20]，通過在凹凸棒土(ATP)表面接枝印跡白藜蘆醇分子印跡聚合物，制備了MIPs 填充濾過型凈化柱(Multiplug filtration clean-up ,m-PFC，圖1)[21]，據(jù)此建立了分子印跡濾過型凈化柱凈化/分子熒光光譜法測定花生根中白藜蘆醇的新方法。與分子印跡固相萃取柱凈化相比，該方法無需固相萃取裝置，用一次性注射器即可完成富集凈化過程，可滿足快速檢測的要求。

1實驗部分

1.1材料與試劑

花生根，采集于廣東省韶關(guān)市大塘鎮(zhèn)(洗凈，烘干，粉碎，過100目篩)；白藜蘆醇、乙烯雌酚(DES)、雙酚A(BPA) 標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，純度>99%)；凹凸棒土(ATP，甘肅靖遠(yuǎn))；β-環(huán)糊精(β-CD)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、α-甲基丙烯酸(MAA)均購自上海阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、甲醇、正己烷(天津科密歐試劑有限公司)，未標(biāo)注試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2實驗儀器

LS-55分子熒光光度計(美國Perkin Elmer 公司)；ZF-7B手提紫外檢測燈(上海顧村電光儀器廠)；濾過型凈化柱空柱管(3 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司)；真空干燥箱-DZF-6050D(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；傅立葉變換紅外光譜儀FTIR-8400S(日本島津公司)；場發(fā)射電子顯微鏡(JSM-7001F，日本電子光學(xué)公司)。

1.3分子印跡聚合物材料的制備

1.3.1β-CD/ATP復(fù)合材料的制備β-CD/ATP復(fù)合材料的合成參照文獻(xiàn)[21]：稱取一定量的ATP，分別用6 mol/L HCl和NaOH回流5 h，活化其表面的硅羥基。然后將3.0 gβ-CD溶于100 mL含 0.3 g NaH的無水DMF中，室溫下攪拌至無氣體放出后，過濾除去多余的NaH，向濾液中加入1.0 g 2,3-(環(huán)氧丙烷)丙基三甲氧基硅烷(KH-560)，在90 ℃油浴和氮氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)5.0 h。隨后升溫至115 ℃，迅速加入5.0 g ATP，攪拌12 h后，產(chǎn)物分別用DMF、甲醇和水洗滌，55 ℃下真空干燥過夜，即得β-CD/ATP復(fù)合材料。

1.3.2分子印跡聚合物(β-CD/ATP-MIPs) 的制備MIPs的合成路線如圖2所示：將0.50 mmol白藜蘆醇、2.0 mmol MAA、1.0 gβ-CD/ATP及15 mL DMF加入100 mL三頸燒瓶中，室溫下振蕩12 h，使模板分子與功能單體預(yù)聚合。然后加入2 mL(10 mmol) EGDMA和30 mg AIBN及20 mL DMF，通氮除氧15 min后，置于60 ℃油浴下避光反應(yīng)24 h，防止白藜蘆醇異構(gòu)化。將所得產(chǎn)品過濾后加至50 mL水中，攪拌1.5 h以洗脫未反應(yīng)的β-CD。最后以甲醇-乙酸(80∶20)作溶劑用索氏提取器洗滌48 h去除模板分子，將所得產(chǎn)物在45 ℃下真空干燥24 h，即得β-CD/ATP-MIPs。 除了不加模板分子外，按相同的方法制得非分子印跡聚合物(NIPs)。將MIPs和NIPs研磨均勻后，過100目篩，置于真空干燥箱中備用。

圖2　分子印跡聚合物的合成路線圖Fig.2　Schematic of the preparation of resveratrol molecularly imprinted polymers

1.4分子印跡聚合物吸附性能研究

分別取20 mg的MIPs和NIPs于50 mL圓底燒瓶中，加入一定量不同濃度的RES標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋振蕩一段時間后，用分子熒光光度計測定溶液中未被吸附的RES濃度，計算吸附容量。吸附容量Qe(mg/g)=(C0-Ce)V/W。式中，C0(mg/L)和Ce(mg/L)分別是RES的初始濃度和平衡吸附后的濃度，V(mL)和W(mg)分別是溶液的體積和吸附劑用量。

1.5花生根中白藜蘆醇的測定

花生根中白藜蘆醇的處理方法見文獻(xiàn)[22]。將新采集的花生根用水洗凈，晾干，剪切成2 cm小段，粉碎后用不同波長的紫外燈照射一段時間。取0.2 g樣品置于微波消解罐中，加入5 mL 70%乙醇，微波功率為中火，提取時間為6 min。提取完畢后，過濾，定容至50 mL。取5 mL提取液，緩慢滴入裝有50 mg MIPs的濾過型凈化柱中，保持滴速為0.5滴/min。上樣完畢后，用甲醇-乙酸(80∶20)將RES洗脫，定容后用分子熒光光度計在激發(fā)波長λex=310.0 nm，發(fā)射波長λem=380.0 nm處測定其熒光強(qiáng)度If。

2結(jié)果與討論

2.1分子印跡聚合物的表征

2.1.1掃描電鏡表征圖3 為β-CD/ATP復(fù)合材料和β-CD/ATP-MIPs的掃描電鏡圖。從圖3可見，光滑的凹凸棒土表面(圖3A)接枝了一層致密多孔的分子印跡聚合物(圖3B)。

圖4　β-CD/ATP(a),β-CD/ATP-MIPs(b)及β-CD/ATP-NIPs(c)的紅外光譜圖Fig.4　FT-IR spectra of β-CD/ATP(a)，β-CD/ATP-MIPs(b) and β-CD/ATP-NIPs(c)

圖5　MIPs和NIPs對RES的吸附容量Fig.5　Adsorption capacities of MIPs and NIPs for RES

AnalyteLinearequationrQe(mg/g)LOD(μg/L)RESy=825.18x+2.050.999710.520.048DESy=790.10x+3.740.99903.680.29BPAy=131.78x+3.560.99933.470.85

2.2分子印跡聚合物吸附容量

用靜態(tài)吸附實驗研究了MIPs和NIPs對RES的結(jié)合性質(zhì)，相應(yīng)的吸附等溫曲線見圖5。由圖可知，在 1～100 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，MIPs對RES的吸附容量明顯增大；底物濃度增至80 mg/L后，繼續(xù)增大底物濃度，MIPs對RES的吸附容量增大不明顯，表明已基本達(dá)到吸附平衡，MIPs的最大吸附容量為12.78 mg/g。而NIPs的吸附量隨著底物濃度的增加只有一個緩慢的變化過程，吸附容量僅為1.79 mg/g。說明MIPs和NIPs存在空間結(jié)構(gòu)差異，MIPs對RES存在特異結(jié)合位點。

2.3分子印跡聚合物的選擇性

以RES的結(jié)構(gòu)類似物乙烯雌酚(DES)和雙酚A(BPA)為競爭底物，考察MIPs對RES的選擇性。準(zhǔn)確移取濃度為40 μg/mL的RES，DES和BPA標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，分別加入20 mg MIPs，渦旋振蕩5 h后，計算各自吸附容量。表1為RES及其類似物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、平衡吸附量及檢出限。由表1可知，MIPs對RES的吸附量約為其結(jié)構(gòu)類似物的3倍。結(jié)果表明，雖然DES和BPA能形成氫鍵作用力的基團(tuán)與RES相同，但其作用位點與RES差別較大，說明MIPs對RES有特異的識別位點。

2.4分子印跡濾過型凈化柱(MIPs-m-PFC)的制備及條件優(yōu)化

將50 mg MIPs濕法裝入濾過型凈化柱，考察了上樣流速、洗脫劑種類及用量、抽提次數(shù)對RES吸附凈化效果的影響。由最優(yōu)RES萃取回收率結(jié)果確定MIPs-m-PFC 凈化富集條件為：上樣流速：0.5滴/min；洗脫劑：甲醇-乙酸(80∶20)；洗脫劑用量：10 mL；抽-壓循環(huán)次數(shù)：5次。

2.5分子印跡濾過型凈化柱的重復(fù)使用性能

在最佳凈化條件下，用裝有50 mg MIPs的凈化柱吸附凈化10.00 mL 40 μg/mL的RES標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述吸附-解吸附過程循環(huán)5次，計算5次循環(huán)MIPs凈化柱對RES的吸附容量。結(jié)果表明，5次吸附-解吸附循環(huán)使用后，MIPs凈化柱對RES的吸附量變化很小，僅從10.14 mg/g降至9.34 mg/g。

2.6紫外光照對花生根中白藜蘆醇含量的影響

用分子印跡凈化柱凈化/分子熒光光譜法測定了經(jīng)不同紫外光照射后花生根中白藜蘆醇的含量，測得未經(jīng)紫外光照的花生根樣品中白藜蘆醇的含量為2.23 mg/g；經(jīng)365 nm的紫外光距離40 cm處照射20 min后，白藜蘆醇的含量為5.17 mg/g；經(jīng)254 nm的紫外光距離30 cm處照射30 min后，白藜蘆醇的含量為6.10 mg/g。由實驗結(jié)果可知，經(jīng)紫外光照處理后，花生根中白藜蘆醇的含量約為未經(jīng)光照的2～3倍。這是因為具有細(xì)胞活性的花生根在光照環(huán)境下，能夠刺激自身合成白藜蘆醇，導(dǎo)致“逆境物質(zhì)”白藜蘆醇的含量成倍增加[22]。

2.7加標(biāo)回收實驗

分別在微波消解的花生根樣品中添加4，8，12 μg/g 3個水平的RES，經(jīng)MIPs凈化柱富集凈化后，用分子熒光光度計測定其RES的含量，結(jié)果見表2。樣品的加標(biāo)回收率為86.2%～102.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.5%～5.8%，說明該方法適用于花生根中白藜蘆醇含量的測定。

表2　花生根樣品中白藜蘆醇的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3結(jié)論

本文以白藜蘆醇為模板分子，具有疏水性內(nèi)腔和帶羥基親水性外腔的大環(huán)化合物β-CD和MAA為雙功能單體，在凹凸棒土表面接枝制備表面分子印跡聚合物。并將MIPs作為吸附劑濕法填充到濾過型凈化柱中，用于花生根樣品中白藜蘆醇的富集純化，建立了分子印跡濾過型凈化柱凈化/分子熒光光譜法測定白藜蘆醇的新方法。該方法操作簡便，準(zhǔn)確快速，滿足樣品中痕量白藜蘆醇的快速檢測要求。

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摘要：以白藜蘆醇(RES)為模板分子，凹凸棒土(ATP)為載體，β-環(huán)糊精(β-CD)和甲基丙烯酸(MAA)為雙功能單體，采用表面分子印跡技術(shù)制備了白藜蘆醇分子印跡聚合物(MIPs)。將制得的分子印跡聚合物作為吸附劑填料，填充濾過型凈化柱，用于富集凈化花生根中的白藜蘆醇，建立了分子印跡濾過型凈化柱凈化/分子熒光光譜測定花生根中白藜蘆醇的新方法。在最優(yōu)化條件下，分子印跡聚合物對RES具有良好的選擇性，最大吸附容量可達(dá)12.78 mg/g，白藜蘆醇在0.1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 7)，方法檢出限為0.048 μg/L，樣品加標(biāo)回收率為86.2%～102.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.5%～5.8%。該方法高效、快速、選擇性好，可用于白藜蘆醇的快速檢測。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；分子印跡聚合物；濾過型凈化柱；分子熒光光譜法；花生根

Determination of Resveratrol in Peanut Root Using Molecularly Imprinted Polymers Multiplug Filtration Clean-up Column Coupled with Fluorescence SpectrometryQIU Xiu-zhen*,PENG Cui-hong,WANG Shao-ling,GUO Hui-shi,LU Lü-quan

(College of Chemistry and Environmental Engineering,Shaoguan University,Shaoguan512005,China)

Abstract：New molecularly imprinted polymers(MIPs) were prepared by using attapulgite(ATP) as the support,β-CD and methacrylic acid(MAA) as functional monomer,resveratrol as template molecule through surface molecularly imprinted polymerization technology.The MIPs were used as sorbent filled into the multiplug filtration clean-up(m-PFC) column for resveratrol enrichment and purification.A new method was developed for the determination of resveratrol by using multiplug filtration clean-up column with molecularly imprinted polymers extraction(MIPs-m-PFCE) combined with fluorescence spectrometry.The results showed that the present method has a high selectivity for RES under the optimized experimental conditions,the adsorption capacity of MIPs was 12.78 mg/g.The calibration curve was linear in the range of 0.1-100 μg/mL with a correlation coefficient(r) of 0.999 7.The limit of detection was 0.048 μg/L.The proposed method was successfully applied in the determination of RES in peanut root,with average recoveries of 86.2%-102.1% and relative standard deviations(RSDs) of 3.5%-5.8% at three spiked levels.The developed method is rapid and selective,and is adaptable to the analysis of trace RES in real samples.

Key words：resveratrol; molecular imprinted polymers; multiplug filtration clean-up column; molecular fluorescence spectrometry; peanut root

中圖分類號：O657.3;TQ460.72

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-4957(2015)12-1403-05

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.013

通訊作者：*丘秀珍，碩士，講師，研究方向：復(fù)雜體系分離分析，Tel：0751-8120118，E-mail:Gold0226@126.com

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金(2014A030307024)；2015年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)立項項目

收稿日期：2015-06-15；修回日期：2015-07-14