談法醫(yī)分子病理學研究實踐

田云霞，徐海宇內蒙古呼倫貝爾市阿榮旗公安局刑事科學技術室

談法醫(yī)分子病理學研究實踐

田云霞，徐海宇
內蒙古呼倫貝爾市阿榮旗公安局刑事科學技術室

在法醫(yī)病理學研究領域里，出現了很多運用分子病理學的基礎性研究和相關的應用研究。此外，除了同一認定之外，分子病理學還有其他用途，如：確定死亡方式和死亡原因、確定死亡時間和血痕形成時間、組織確認、損傷時間推斷、毒理遺傳學等。有學者使用分子病理學技術診斷心律失常，并提出了分子解剖的概念。與臨床研究不同，法醫(yī)病理的主要對象還是尸體組織，尤其是腐敗組織，或者甲醛浸泡的組織。也正因如此，法醫(yī)學者不太可能依靠分子病理來解決所有的問題，我們的目的是嘗試解決一些基本的、常見的問題。

法醫(yī)；分子病理學；研究實踐

在法醫(yī)病理學研究領域里，出現了很多運用分子病理學的基礎性研究和相關的應用研究。此外，除了同一認定之外，分子病理學還有其他用途，如：確定死亡方式和死亡原因、確定死亡時間和血痕形成時間、組織確認、損傷時間推斷、毒理遺傳學等。有學者使用分子病理學技術診斷心律失常，并提出了分子解剖的概念。與臨床研究不同，法醫(yī)病理的主要對象還是尸體組織，尤其是腐敗組織，或者甲醛浸泡的組織。也正因如此，法醫(yī)學者不太可能依靠分子病理來解決所有的問題，我們的目的是嘗試解決一些基本的、常見的問題。

一、死亡原因

確定死亡原因有不同的方法，而不同的方法對應不同的檢驗對象。傳統(tǒng)死因確定的方法是尸體解剖，解剖用于推斷死亡原因時，有個別案件由于缺乏形態(tài)學的陽性改變，故分析死因時存在一定的困難。解剖加上其他一些輔助性方法，如組織化學、死后生化和毒物分析等方法后，大多數案件可以正確診斷死因。但是還是會有很少部分的案件難以診斷出來，如心律失常死亡案件。此外，青少年猝死案例中很多就死因不明，據統(tǒng)計約有30%青壯年心源性猝死案例解剖時是陰性的。這部分案例中，很多都有家族遺傳傾向。這種情況下，檢測突變基因就變得極為重要。但是檢測突變基因時要注意這些突變在功能上的重要性，以及這些基因突變與死因存在的直接關聯性。

感染性疾病的診斷。分子病理學技術在診斷感染性疾病方面也有重要作用，而且可用于年代久遠的尸體組織疾病診斷，如木乃伊組織。在法醫(yī)學領域，該技術目前主要用于診斷心肌炎。

常見的引起病毒性心肌炎的病毒包括腺病毒、腸道病毒、禽流感病毒、細小病毒B19等?；铙w上病毒性心肌炎的診斷除了依靠病史和臨床檢查外，還需要心內膜活檢。活檢的心內膜可通過PCR、RT－PCR以及原位雜交、免疫組化來尋找病毒感染的證據。但是分子病理檢測結果與免疫組織化學染色診斷結果不一定相關。如形態(tài)學上正常的心臟可出現病毒檢測陽性，反之亦然。心肌內檢出病毒可以用于死因診斷，尤其是出現了心肌壞死、心肌細胞自溶以及淋巴單核細胞浸潤時更是如此。已經有一些有關猝死案例中檢出病毒的文獻報道。對于嬰幼兒猝死綜合征來說，大概30%的案例可檢出病毒，尤其是腸病毒、腺病毒或者細小病毒B19等，而這些發(fā)現可作為死因診斷的依據。

二、RNA分析

死后RNA分析在法醫(yī)中很有應用價值，如可用于組織鑒定或者死亡時基因表達水平的判定。死亡時基因表達水平的判定對于死因和死亡環(huán)境、存活時間、疾病的病理生理變化以及損傷判定來說很有意義。但是基因表達水平的判定，首先要解決的問題是死后內參基因的選擇問題。RNA分析能為判斷引起死亡的疾病及死亡機制提供思路，也有望成為法醫(yī)病理死因診斷的有力工具。當然還有一些其他應用，如判定損傷時間、死亡時間及體液鑒定等。

1.血痕形成時間和死亡時間判定

體外RNA降解是一個復雜而非線性的過程，但是其降解程度可用做斑痕質量和形成時間判定的指標。Bauer等（2008）研發(fā)了一種聯合使用半定量雙RT－PCR和競爭式RT－PCR的方法來量化RNA降解水平。他們采用這種方法研究了106例血痕。這些血痕保存時間最長達15年。結果發(fā)現標準品與目的基因mRNA的峰面積比值與樣品保存時間相關。血痕形成時間差別在5年及以上的樣品中，標準品與目的基因mRNA峰面積比值具有明顯差異。此外Bauer等（2003）也利用FASN多重PCR方法對PNA片段進行定量，并表明這些RNA量與死亡時間相關?？俁NA降解在實驗條件下是一個緩慢的過程，因此可用于死亡時間3～4d之內的PMⅠ研究。

2.體液鑒定

通過測定組織細胞特異性基因mRNA量來鑒定組織是一種除DNA分型以外的另一種新技術。這里面最主要的是選取組織特異性的基因，通過反轉錄PCR來研究該特異性基因的表達情況。如基質金屬蛋白酶（MMP）mRNA只存在于子宮內膜細胞而不能在其他血細胞和上皮細胞內檢出，因此可作為內膜細胞特異性基因，即有望成為月經血的特異性指標。進一步的月經血斑痕研究顯示MMP表達水平確實可作為月經血檢測的特異指標。

3.mRNA

目前通過mRNA定量分析來鑒定體液是一種標準的常用方法。也有很多研究逐步改善了該方法，以提高方法的精確度，擴大該方法檢測的生物檢材種類。然而，mRNA在死后容易降解，因此其穩(wěn)定性一直是檢測基因表達時的關注點。有研究報道m(xù)RNA降解后，受損的"八完整性會影響到檢測效果。這對法醫(yī)采用mRNA定量來說尤其重要，因為法醫(yī)碰到的檢材經常暴露于蚊蟲、紫外線、溫度、濕度等潛在促進mRNA降解的環(huán)境中。雖然mRNA穩(wěn)定性廣受質疑，但是毫無疑問的一點是，某一小段長度的單鏈RNA可能不易降解而具有較好的穩(wěn)定性。因此在法醫(yī)領域具有重要的研究價值。

4.法醫(yī)病理學家對死者親屬的責任

檢測到死者突變基因后，法醫(yī)也有責任對死者家屬進行風險告知和遺傳咨詢。當分子解剖得出合理的死因之后，法醫(yī)也有義務告知家屬所有的解剖結果。由于一些遺傳疾病，如擴張性心肌病和長QT綜合征等具有遺傳傾向，死者家屬也很有可能罹患同樣的疾病，因此告知家屬可以有效預防悲劇再生。遺傳咨詢是對心源性猝死者家屬關懷必不可少的一部分，因此，需要法醫(yī)病理學家、醫(yī)學遺傳學家以及心臟病學家通力合作。法醫(yī)病理學家的基本任務就是要考慮到心源性猝死案例的遺傳因素，并且合理保存組織檢材以備后續(xù)基因分析。