鐘琴,張燕翔,錢(qián)鋒,楊波,任伯緒　(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

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腦組織冰凍切片漂片法與石蠟切片貼片法的免疫組化效果比較

鐘琴,張燕翔,錢(qián)鋒,楊波,任伯緒(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

[摘要]目的:比較腦組織冰凍切片與石蠟切片免疫組化的效果。方法:健康雄性昆明小鼠20只，腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。24h后成功模型小鼠腦灌注固定，斷頭取腦，隨機(jī)分別取8只行冰凍切片40μm(A組)與石蠟切片4μm(B組)，采用羊抗鼠DCX(1：200)抗體，以SABC法進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果:A組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且A組鏡下視野切片染色更加清晰，對(duì)比良好。結(jié)論:腦組織切片免疫組化染色采用冰凍切片漂片法效果更為可靠。

[關(guān)鍵詞]冰凍切片；石蠟切片；免疫組化；癲癇

隨著神經(jīng)科學(xué)的不斷發(fā)展，腦組織免疫組化技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于神經(jīng)學(xué)研究。由于腦組織本身具有柔軟、含水量大等特點(diǎn)，其石蠟切片的免疫組化染色結(jié)果易出現(xiàn)切片染色不清楚、脫片、假陽(yáng)性、假陰性等問(wèn)題[1]，很難得到高質(zhì)量的腦組織免疫組化切片。本實(shí)驗(yàn)采用癲癇持續(xù)狀態(tài)模型(status epilepticus, SE)，用免疫組化的方法檢測(cè)海馬齒狀回下區(qū)編碼微管相關(guān)蛋白(DCX)陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)，對(duì)比腦組織冰凍切片漂片法與石蠟切片貼片法免疫組化的效果，以期更好的開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究工作。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

健康雄性昆明小鼠20只，體質(zhì)量(30±5)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供；東莨菪堿、匹羅卡品由Sigma公司提供；免疫組化ABC試劑盒、DCX羊抗鼠一抗、驢血清、驢抗羊二抗由Santa cruze公司提供。

1.2方法

1)模型制備腹腔注射東莨菪堿1mg/kg，30min后腹腔注射匹羅卡品280mg/kg，觀(guān)察小鼠一般行為變化。按Racine的6級(jí)抽搐行為評(píng)估，表現(xiàn)為Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作，且癲癇狀態(tài)至少持續(xù)60min以上，即為SE模型制備成功[4]。0級(jí)：無(wú)任何發(fā)作跡象；Ⅰ級(jí)：頭面部抽搐；Ⅱ級(jí)：節(jié)律性點(diǎn)頭或濕狗樣抖動(dòng)；Ⅲ級(jí)：雙側(cè)前肢抽搐不伴后肢站立；Ⅳ級(jí)：全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，并后肢站立，不伴摔倒；Ⅴ級(jí)：全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，并后肢站立伴摔倒。

2)樣本制作與分組成功模型小鼠24h后麻醉，開(kāi)胸從左心室插管至升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，先快速灌注生理鹽水，待流出的生理鹽水灌流液澄清后，再用三通管換成由0.1M PBS配制的4%多聚甲醛200～250mL，滴注約1～1.5h。待小鼠全身固定僵硬后，斷頭取腦。隨機(jī)分別抽取8只分為2組：A組行冰凍切片免疫組化、B組行石蠟切片免疫組化(4只死亡舍棄)。

3)免疫組化A組冰凍切片免疫組化漂片法:取腦后置于4%多聚甲醛4℃后固定8～10h，再將腦組織轉(zhuǎn)入由0.1M PB配制的30%蔗糖溶液中，4℃放置待腦沉底后取出，切取腦視神經(jīng)交叉根部與四疊體之間3～4mm的包含海馬層面的腦組織，用OCT包埋液氮速凍，行冰凍切片，片厚約40μm。逐一切片后，依次放入裝有0.1M PB的24孔板中。0.01M檸檬酸緩沖液微波修復(fù)后，采用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

B組石蠟切片免疫組化貼片法:取腦后置于4%多聚甲醛室溫后固定24h后，常規(guī)石蠟脫水、包埋、切片約4μm。0.01M檸檬酸緩沖液微波修復(fù)后，采用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1小鼠一般行為學(xué)變化

小鼠注射匹羅卡品后平均15min左右出現(xiàn)節(jié)奏性咀嚼、肢體抽搐、吐涎等表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)強(qiáng)直痙攣。本實(shí)驗(yàn)造模過(guò)程中，小鼠癲癇大發(fā)作后死亡4只，成功造成SE模型16只。

2.2陽(yáng)性結(jié)果大體觀(guān)察

A組冰凍切片漂片法：所有腦組織切片海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見(jiàn)DCX陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞，染色背景清晰，對(duì)比明顯，但有小部分腦片染色不均，且部分腦片破損、碎爛(圖1)。

B組石蠟切片貼片法：所有腦組織切片海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見(jiàn)DCX陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞，但腦片染色背景很深，不過(guò)基本上所有腦切片完整性保持較好(圖2) 。

圖1　冰凍切片漂片法顆粒下區(qū)DCX陽(yáng)性　　　　　　　　　圖2　石蠟切片貼片法顆粒下區(qū)DCX陽(yáng)性　神經(jīng)元的表達(dá)(×400)　神經(jīng)元的表達(dá) (×400)

2.3海馬齒狀回顆粒下區(qū)DCX陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)分析

海馬齒狀回顆粒下區(qū)DCX陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)：冰凍切片漂片法陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)個(gè)數(shù)為(10.25±2.31)個(gè)，高于石蠟切片貼片法陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)個(gè)數(shù)(8.13±2.03)個(gè)(P<0.05)。

3討論

以匹羅卡品點(diǎn)燃大鼠癲癇模型具有同人類(lèi)SE或顳葉癲癇相似發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，如海馬門(mén)區(qū)神經(jīng)元的死亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生、軸突絲狀芽生和突觸重建等，是理想的顳葉癲癇模型，常用于探討其機(jī)制及篩選抗癲癇藥物，另外還有其它化學(xué)藥物可制備癲癇動(dòng)物模型如海人酸、戊四唑、青霉素等[2～5]。本實(shí)驗(yàn)以匹羅卡品誘導(dǎo)建立SE模型，產(chǎn)生的行為表現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單方便，成功率高。

DCX是一種編碼微管相關(guān)蛋白，可促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。DCX作為研究神經(jīng)元遷移、分化、再生的標(biāo)記物，通過(guò)對(duì)其表達(dá)的研究可使我們了解神經(jīng)元的分化與再生情況。已有研究表明海人酸誘導(dǎo)的癲癇模型中，癲癇刺激后齒狀回顆粒下區(qū)DCX的表達(dá)明顯增加，并出現(xiàn)向細(xì)胞區(qū)遷移的趨勢(shì)[6～8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有SE模型小鼠腦組織切片在海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見(jiàn)DCX的明顯表達(dá)，且冰凍切片漂片法比石蠟切片貼片法的實(shí)驗(yàn)效果好，染色背景清晰，對(duì)比明顯。

免疫組化常用的方法有漂片法和貼片法，但做共聚焦切片時(shí)，需要厚片一般30～50μm才能達(dá)到三維重建的效果。腦組織本身比較柔軟、含水量大等特點(diǎn)，造成腦組織免疫組化相對(duì)其他組織比較困難。冰凍切片最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存細(xì)胞在固定狀態(tài)的酶和抗原活性，出結(jié)果相對(duì)容易，但其缺點(diǎn)是不能長(zhǎng)期存放，裱片時(shí)相當(dāng)困難，腦片易皺易破。而石蠟切片雖具有組織結(jié)構(gòu)保存良好、假陽(yáng)性誤斷力減低、可永久保存的優(yōu)點(diǎn)，但制作過(guò)程較復(fù)雜，對(duì)組織損傷較大，難以保證連續(xù)切片。免疫組化過(guò)程中可能會(huì)碰到各種問(wèn)題，要分析原因，去尋找相應(yīng)的解決辦法。本實(shí)驗(yàn)在做免疫組化過(guò)程中，無(wú)論石蠟切片還是冰凍切片，都采用了微波熱修復(fù)抗原，可以提高陽(yáng)性檢出率和陽(yáng)性強(qiáng)度[9]。另外，為了克服爛片碎片，筆者認(rèn)為需要注意以下幾點(diǎn)：①液氮速凍時(shí)，可以在腦組織周?chē)m量OCT膠后，再將樣品連同樣品托放入液氮數(shù)10s左右，這樣可防止腦組織因冰凍不均而產(chǎn)生裂痕。②腦組織洗片時(shí)，不宜用移液槍正對(duì)腦片直接沖洗，或?qū)⒛X片吸入移液槍?zhuān)蛑苯咏佑|腦片，槍頭應(yīng)貼壁、遠(yuǎn)離腦組織。③裱片時(shí)，動(dòng)作要輕柔，勿直接用毛筆牽拉腦片。

總之，匹羅卡品可成功誘導(dǎo)SE小鼠模型，小鼠致癇后其海馬齒狀回顆粒下區(qū)明顯可見(jiàn)DCX陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)，其表達(dá)相對(duì)正常小鼠如何變化，有待進(jìn)一步研究；通過(guò)兩種方法的對(duì)比，腦組織切片免疫組化染色采用冰凍切片漂片法效果優(yōu)于石蠟切片貼片法。

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[編輯]劉陽(yáng)

[引著格式]鐘琴,張燕翔,錢(qián)鋒，等.腦組織冰凍切片漂片法與石蠟切片貼片法的免疫組化效果比較[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2015，12(36):95～97.

[中圖分類(lèi)號(hào)]R361

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2015)36-0095-03

通信作者：

[作者簡(jiǎn)介]鐘琴(1990-)，女，碩士生，主要從事醫(yī)學(xué)影像診斷研究工作；任伯緒，boxuren188@163.com。

[基金項(xiàng)目]荊州市2014年度科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014AC47E)。