中華蜜蜂遺傳資源保護(hù)的方案與路徑（續(xù)）

王紅芳 劉振國(guó) 王穎 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018）

中華蜜蜂遺傳資源保護(hù)的方案與路徑（續(xù)）

王紅芳 劉振國(guó) 王穎 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018）

（續(xù)2016年《中國(guó)蜂業(yè)》第11期）

在對(duì)蜂王實(shí)施人工授精之前有兩項(xiàng)重要的準(zhǔn)備工作，培育健壯的雄蜂和性能良好的處女王。雄蜂的培育需要選擇強(qiáng)壯的蜂群和適宜的環(huán)境條件，否則會(huì)影響雄蜂的發(fā)育。通常培育雄蜂的時(shí)間在移蟲(chóng)育王前15～20天較為合適。培育雄蜂數(shù)量根據(jù)處女王數(shù)量而定，一般給1只處女王授精需要8～10只左右的成熟雄蜂，為了避免雄蜂發(fā)育不完全或者飛散到其他蜂群而導(dǎo)致無(wú)法使用的情況，實(shí)踐中雄蜂與處女王的比例通常為100∶1[20]。處女王的培育要根據(jù)養(yǎng)蜂生產(chǎn)中對(duì)蜂群性狀的記錄，有目的的選擇相應(yīng)的母群進(jìn)行移蟲(chóng)育王。

蜜蜂人工授精實(shí)驗(yàn)室需要具備一些必要的儀器設(shè)備，包括人工授精儀、微量注射器、電子天平、體視顯微鏡、生物顯微鏡、純水儀、血球計(jì)數(shù)板、酸度計(jì)、離心機(jī)、紫外滅菌燈、高壓滅菌鍋、二氧化碳鋼瓶、氣體洗瓶、醫(yī)用手術(shù)盤(pán)、手術(shù)剪、鑷子、雄蜂飛翔籠、混精設(shè)備以及背腹鉤和探針等設(shè)備。在實(shí)施人工授精之前需要將實(shí)驗(yàn)室和所有的器具設(shè)備進(jìn)行消毒。準(zhǔn)備就緒后，捕捉雄蜂采集精液，選取飛翔有力、腹部堅(jiān)挺的雄蜂，右手食指、拇指與左右食指配合使用，擠壓雄蜂腹部1～3節(jié)，強(qiáng)迫雄蜂陽(yáng)莖、羽狀突和陽(yáng)莖球外翻，然后用注有生理液（含抗生素）的微量注射器采集陽(yáng)莖球表面淡黃色的精液，注意避免吸入空氣和黏液。然后用二氧化碳將蜂王麻醉，固定與人工授精儀底部的麻醉室內(nèi)，背、腹鉤配合打開(kāi)蜂王蜇針腔，調(diào)整微量注射器角度，從蜂王陰道口處進(jìn)針進(jìn)行精液注射。完成人工授精后的蜂王會(huì)很快蘇醒，然后將其放入蜂群，觀察產(chǎn)卵情況。

3.3 雄蜂精液的低溫儲(chǔ)藏技術(shù)

利用超低溫貯存技術(shù)保存雄蜂精液通常是基因庫(kù)保種的重要方式。蜜蜂精液冷凍貯存技術(shù)，是利用無(wú)毒或低毒的抗冷凍保護(hù)劑滲透進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間，通過(guò)胞外高滲透壓溶液將精細(xì)胞內(nèi)的游離水分析出，以達(dá)到減少精細(xì)胞在超低溫冷凍時(shí)受到冰晶損傷的目的，從而最大限度地保持住蜜蜂精子的自然狀態(tài)和受精能力[16]。蜜蜂精液超低溫貯存技術(shù)的流程包括冷凍稀釋液的配制、精液采集與稀釋、鏡檢精子活力、精液分裝與降溫平衡、精液冷凍、貯存與運(yùn)輸、精液解凍、鏡檢精子活力、精液漂洗濃縮、受精試驗(yàn)，核心步驟主要指精液的稀釋、冷凍和解凍。

精液在進(jìn)行冷凍前，要進(jìn)行前處理，即稀釋。所用的稀釋倍數(shù)、稀釋方法、稀釋液種類(lèi)與精子活力的恢復(fù)密切相關(guān)。由于精液中大部分是水分，經(jīng)稀釋后含水量可達(dá)95～99%，在凍結(jié)過(guò)程中，水分會(huì)形成冰核，對(duì)精子細(xì)胞造成損傷，大大降低其活力。Lusena發(fā)現(xiàn)許多無(wú)機(jī)鹽、醇、甘油、糖、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)等能使冰晶晶核增長(zhǎng)速度減慢，在冷凍過(guò)程減少對(duì)細(xì)胞的損傷[17]。因此，精液稀釋液會(huì)含有不同比例的上述物質(zhì)。在稀釋方法上通常有兩種，一次稀釋法和二次稀釋法，主張二次稀釋法者認(rèn)為，甘油對(duì)精子有一定的毒害作用[18]，且毒害程度隨溫度的升高而加劇。為了減輕甘油對(duì)精子細(xì)胞的不利影響，先用不含甘油的稀釋液進(jìn)行第一稀釋?zhuān)鋮s到0～5℃，再用已經(jīng)冷卻到同等溫度的含甘油的稀釋液進(jìn)行第二次稀釋。

精液冷凍常用的方法包括三種：顆粒冷凍、細(xì)管冷凍和程序冷凍儀冷凍。顆粒凍精是將稀釋好的精液逐滴滴到冷凍板上，此方法的降溫速度是通過(guò)精液滴的大小和降溫劑的溫度來(lái)控制的。但采用這種方法的弊端是，精液顆粒之間的初始冷凍溫度不同，隨著滴入精液數(shù)量的增加，冷凍面溫度上升，初始冷凍溫度也在上升，使精液整體降溫速度緩慢，通過(guò)危險(xiǎn)溫度區(qū)的時(shí)間延長(zhǎng)，很容易影響凍精質(zhì)量。細(xì)管凍精是在液氮蒸汽中進(jìn)行，可保證每只細(xì)管冷凍的初始溫度是相同的，并減少了外界氣溫的影響，冷凍速度較快，能很快度過(guò)危險(xiǎn)溫度區(qū)達(dá)到熱平衡。程序冷凍儀發(fā)明后，很多科研工作者開(kāi)始采用程序冷凍儀進(jìn)行凍精。相對(duì)前兩者而言，程序冷凍法可實(shí)現(xiàn)溫度梯度降溫的程序化，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，溫度容易控制，且初始冷凍溫度一致。

使用冷凍的蜜蜂精液前，需要解凍。解凍與冷凍過(guò)程同等重要，同樣需要減少溫度危險(xiǎn)區(qū)對(duì)精子活性與質(zhì)量的影響。一般冷凍——解凍過(guò)程對(duì)精子存活的危險(xiǎn)溫度區(qū)為-50～-15℃。為了迅速通過(guò)危險(xiǎn)溫度區(qū)，解凍過(guò)程需采用快速升溫的方法[19]。

4.保種檔案的建立與管理

為了有效了解保種群體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和發(fā)展趨勢(shì)，加強(qiáng)保種單位的責(zé)任制度，促進(jìn)保種工作的完善和提高，必須在保種場(chǎng)（保護(hù)區(qū)）建立蜜蜂保種檔案。保種檔案主要包括種群原始檔案和種群系譜檔案。種群原始檔案是保種場(chǎng)最基礎(chǔ)的資料，為了便于觀察、記錄和歸檔，通常先要對(duì)原始蜂群進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)可采用以下形式：蜂種+世代年份+群號(hào)。蜂種可以首字母表示，例如，中蜂表示為Z；親代用P表示，子一代，子二代，子三代……分別用阿拉伯?dāng)?shù)字1,2,3……表示。年份和群號(hào)按客觀情況自定義標(biāo)號(hào)，例如，2015001表示2015年1號(hào)蜂群。種群檔案通常需要記錄每個(gè)種群的形態(tài)特征、經(jīng)濟(jì)性狀、生產(chǎn)性能、生物學(xué)特性以及種蜂王的父母群信息、出房體重、體長(zhǎng)、體色、出房日期、婚飛日期、產(chǎn)卵日期等。系譜檔案則包括兩部分：原種蜂王系譜卡和系譜圖。原種蜂王系譜卡記錄原種蜂王的編號(hào)、品種（品系）、原產(chǎn)地、培育單位、培育時(shí)間及相關(guān)備注等；系譜圖主要用來(lái)表示子代和親代的血緣關(guān)系。

隨著電子信息技術(shù)的發(fā)展，保種檔案和系譜資料的記錄與保管也應(yīng)該隨之發(fā)展。記錄與保管形式應(yīng)該多樣化、信息化，即包括傳統(tǒng)紙質(zhì)資料，又該引入現(xiàn)代化的電子資料。紙質(zhì)資料必須保存，因?yàn)樵诒７N現(xiàn)場(chǎng)（尤其是無(wú)網(wǎng)絡(luò)的野外條件）紙質(zhì)資料是最方便記錄的一種形式，同時(shí)可將紙質(zhì)資料錄入電腦備份，以防丟失。此外，信息化電子資料的介入會(huì)大大豐富記錄形式、簡(jiǎn)化查閱過(guò)程。例如，可以建立蜂種檔案記錄系統(tǒng)甚至建立相應(yīng)的網(wǎng)站，在查詢(xún)過(guò)程中，只需點(diǎn)擊相應(yīng)的蜂王編號(hào)，即可調(diào)出該蜂王的全部個(gè)體信息、群體信息、繁衍記錄以及系譜關(guān)系等。這種蜂場(chǎng)記錄軟件和系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用應(yīng)該是未來(lái)蜜蜂保種場(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)記錄蜂群信息的主要趨勢(shì)。

5.中蜂種質(zhì)資源的利用

中華蜜蜂保種的最終目的是為養(yǎng)蜂生產(chǎn)服務(wù)，不能為單純的保種而保種，即要體現(xiàn)中華蜜蜂種質(zhì)資源保種的應(yīng)用價(jià)值，主要包括在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中的應(yīng)用與在蜜蜂育種中的應(yīng)用。

5.1 用于養(yǎng)蜂生產(chǎn)

中蜂種質(zhì)資源在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。我國(guó)目前擁有蜂群800多萬(wàn)群，其中中蜂占200多萬(wàn)群，在我國(guó)養(yǎng)蜂生產(chǎn)中具有重要地位。如海南中蜂、阿壩中蜂、西藏中蜂、長(zhǎng)白山中蜂、華南中蜂、北方中蜂等，都是當(dāng)?shù)刂蟹渖a(chǎn)區(qū)的主產(chǎn)品種，為當(dāng)?shù)刂蟹渖a(chǎn)發(fā)揮了重要作用[4]。特別是近年來(lái)，中蜂蜂蜜價(jià)格昂貴，為中蜂的養(yǎng)蜂生產(chǎn)創(chuàng)造了較高的經(jīng)濟(jì)效益。因此，中蜂的保種要將原生態(tài)保種與人工飼養(yǎng)相結(jié)合[5]，在一個(gè)保種場(chǎng)建立多個(gè)保種點(diǎn)，一是避免單一保種點(diǎn)遭遇病害侵襲全場(chǎng)毀滅；二是可在保種場(chǎng)內(nèi)選擇部分保種點(diǎn)進(jìn)行原生態(tài)保種（不參入人為干預(yù)），保持中蜂原始生活習(xí)性與優(yōu)良性狀，另一部分保種點(diǎn)進(jìn)行人工選擇與飼養(yǎng)，使得中蜂優(yōu)良的生產(chǎn)性狀得以保留和提高，從而更好的服務(wù)于生產(chǎn)。

5.2 用于中蜂的提純復(fù)壯

我國(guó)地方蜂種是一種寶貴的資源，它是在我國(guó)特有的自然條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇而形成的，一個(gè)品種就是一個(gè)基因庫(kù)，匯集著各種各樣的優(yōu)良基因。相比于西方蜜蜂，它具備了一些特有的優(yōu)良性狀。例如中蜂抗亮熱厲螨，北方中蜂、長(zhǎng)白山中蜂的抗寒性，云貴高原中蜂、西藏中蜂的耐高海拔性等?？梢?jiàn)，中蜂有著良好的抗逆性，這正是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴養(yǎng)的西方蜜蜂所缺乏的特質(zhì)。但是，長(zhǎng)期以來(lái)由于外來(lái)西方蜂種的沖擊和威脅以及環(huán)境污染等問(wèn)題導(dǎo)致本土中蜂數(shù)量銳減、種性退化，甚至部分區(qū)域類(lèi)型的中蜂瀕臨滅絕。通過(guò)開(kāi)展中蜂的保種工作，可將所保中蜂用于相應(yīng)類(lèi)型中蜂的提純復(fù)壯，恢復(fù)的群體數(shù)量和品種特性。因此，對(duì)中蜂的保護(hù)實(shí)際也是對(duì)中蜂種質(zhì)資源多樣性的保護(hù)。

6 結(jié)語(yǔ)

中蜂保護(hù)是我國(guó)養(yǎng)蜂業(yè)的重要任務(wù)。目前，中蜂的保種方式主要包括保種場(chǎng)保種、保護(hù)區(qū)保種和基因庫(kù)保種。在保種技術(shù)上主要涉及蜜蜂的閉鎖繁育技術(shù)、蜜蜂精液超低溫貯存技術(shù)以及蜜蜂的人工授精技術(shù)。雖然我國(guó)中蜂保護(hù)已取得了卓有成效的進(jìn)展：建立了兩個(gè)國(guó)家級(jí)中蜂保護(hù)區(qū)、三個(gè)國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)和一個(gè)蜜蜂基因庫(kù)。但中蜂保種的具體技術(shù)路徑和地方蜂種資源的應(yīng)用仍需進(jìn)一步完善、拓展，值得廣大蜜蜂工作者思考和探索。

[1]鄒樹(shù)文.中國(guó)昆蟲(chóng)學(xué)史[M].北京:科學(xué)出版社,1981,144.

[2]楊冠煌.中華蜜蜂[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社,2001,1-37.

[3]彭楚云.蜂種退化原因與改進(jìn)辦法淺析[J].蜜蜂雜志,2000,2: 21-22.

[4]國(guó)家畜禽遺傳資源編委會(huì).蜜蜂志[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011,19-20.

[5]張大利.中華蜜蜂保種保護(hù)模式探討[J].中國(guó)蜂業(yè),2015,66: 40-41.

[6]李紫劍.談中蜂保護(hù)區(qū)[J].蜜蜂雜志,2011,5:46.

[7]吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所.蜜蜂基因庫(kù)的保種工作[J].中國(guó)畜牧業(yè),2012,11:24-25.

[8]Woyke J.What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony[J]J Apic Res,1963,2:73-75.

[9]Woyke J.Effect of sex allele homo-heterozygosity on honeybee colony populations and on their honey production.I.Favourable development conditions and unrestricted queen[J].J Apic Res,1980, 19:51-63.

[10]Woyke J.Effect of sex allele homo-heterozygosity on honeybee colony populations and on their honey production.II.Unfavourable development conditions and restricted queens[J].J Apic Res,1981,20:148-155.

[11]Page RE,Laidlaw HH.Closed population honeybee breeding. 1.Population genetics of sex determination[J].J Apic Res.1982a, 21:30-37.

[12]Page RE,Laidlaw HH.Closed population honeybee breeding. 2.Comparative methods of stock maintenance and selective breeding[J].J Apic Res,1982b,21:38-44.

[13]Page RE,Laidlaw HH,Erickson EH.Closed population honeybee breeding.3.The distribution of sex alleles with gyne supersedure[J].J Apic Res,1983,22:184-190.

[14]Page RE,Laidlaw HH.Closed population honeybee breeding [J].Bee World,1985a,66:63-72.

[15]Page RE,Laidlaw HH,Erickson EH.Closed population honeybee breeding.4.The distribution of sex alleles with top crossing [J].J Apic Res,1985b,24:38-42.

[16]薛運(yùn)波.蜜蜂活體保種和遺傳材料保存技術(shù)[A].國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蜜蜂育種與授粉功能研究室學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)養(yǎng)蜂學(xué)會(huì)蜜蜂育種專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第四屆第一次會(huì)議暨中國(guó)養(yǎng)蜂學(xué)會(huì)蜜源與蜜蜂授粉專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第五屆第一次會(huì)議論文匯編.2012.7.30.

[17]Lusena CV.Ice propagation in systems of biological interest. III.Effect of solutes on nucleation and growth of ice crystals[J]. Arch Biochem Biophys,1955,57(2):277-84.

[18]Wilmut I,Polge C.The fertilizing capacity of boar semen stored in the presence of glycerol at 20,5 and-79 degrees C[J].J Reprod Fertil,1974,38(1):105-13.

[19]陳國(guó)宏,王麗華.蜜蜂遺傳育種學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2010,243-245.

[20]薛運(yùn)波.蜜蜂人工授精技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2016, 63-109.