賀　羽，趙秘密，楊致邦，周　汛，3

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孢子絲菌復(fù)合體的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

賀羽1，趙秘密1，楊致邦2，周汛1，3

孢子絲菌是人獸共患性真菌，感染人或動(dòng)物可引起孢子絲菌病。以往形態(tài)學(xué)鑒定認(rèn)為申克孢子絲菌(Sporothrixschenckii，S.schenckii)為孢子絲菌病的唯一致病菌種，而近年來分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該菌是6個(gè)菌種構(gòu)成的復(fù)合體，并且在基因鑒定、基因組學(xué)、發(fā)病機(jī)制等方面有了進(jìn)一步研究，有利于理解孢子絲菌病的發(fā)生發(fā)展過程，對(duì)于早期診斷、確定治療方案及判斷預(yù)后至關(guān)重要。本文就孢子絲菌復(fù)合體的分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

孢子絲菌；基因鑒定；基因組；發(fā)病機(jī)制；分子生物學(xué)

孢子絲菌是人獸共患性真菌，感染人或動(dòng)物可引起皮膚、皮下組織及附近淋巴系統(tǒng)的慢性肉芽腫性病變，偶可經(jīng)血液、淋巴系統(tǒng)播散引起系統(tǒng)性損害[1]，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。孢子絲菌由美國人Shenk首次發(fā)現(xiàn)，故被命名為申克孢子絲菌[2]。以往形態(tài)學(xué)鑒定認(rèn)為申克孢子絲菌為孢子絲菌病的唯一致病菌種，而近年來分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該菌是多個(gè)菌種構(gòu)成的復(fù)合體[3]。生物信息學(xué)的發(fā)展讓我們對(duì)孢子絲菌有了更多更新的認(rèn)識(shí)，本文就近年來孢子絲菌復(fù)合體在基因鑒定、基因組學(xué)、發(fā)病機(jī)制方面的分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　基因鑒定

1.1基因分型孢子絲菌的基因分型通?；趍tDNA限制性內(nèi)切酶HaeⅢ的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，Lin等首次將不同地區(qū)S.schenckii菌株的mtDNA分成24種亞型，而后25到30種，以及31到32種亞型被相繼發(fā)現(xiàn)[4]，并將32種亞型劃分為A、B 2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育組，不同亞型其地理分布存在差異。研究者采用ITS-RELP分析將rDNA分為4個(gè)亞型[5]，其中Ⅰ-Ⅲ型與A組一致，Ⅳ型與 B組一致。張振穎等采用RFLP 技術(shù)和Southern印跡法進(jìn)行rDNA基因分型發(fā)現(xiàn)我國不同地區(qū)31株臨床孢子絲菌顯示出15種不同的DNA帶型(A-O)，51.6%DNA模帶為A-C型，南方和北方菌株存在明顯差異，但不能明確基因型與臨床型別間的關(guān)系[6]。張萍等采用多聚酶鏈反應(yīng)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA法研究發(fā)現(xiàn)新疆申克孢子絲菌顯示出新基因型，與北京固定型孢子絲菌病致病菌存在種內(nèi)基因差異，而與北京、哈爾濱淋巴型孢子絲菌致病菌間未見種內(nèi)基因差異[7]。

1.2菌種鑒定及基因診斷通過保守序列包括CAL、ITS及β-tubulin基因變異分析發(fā)現(xiàn)孢子絲菌復(fù)合體包含6個(gè)菌種，包括巴西孢子絲菌(Sporothrixbrasiliensis，S.brasiliensis)、球形孢子絲菌(Sporothrixglobosa，S.globosa)、申克孢子絲菌等[3, 8-9]，菌種不同其毒力、地理分布、藥物敏感性等存在差異。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為準(zhǔn)確而快速鑒定菌種提供了新方法，對(duì)于早期明確致病菌種類型以指導(dǎo)治療具有重要意義。利用通用引物T38的PCR指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)各隱含種顯示出不同電泳條帶，與利用CAL基因分析鑒定菌種的結(jié)果一致[10]。Rodrigues等運(yùn)用CAL基因的PCR-RFLP分析實(shí)現(xiàn)了對(duì)孢子絲菌復(fù)合體各隱含種的基因鑒定[11]，認(rèn)為該方法準(zhǔn)確、簡單且成本低，可用于常規(guī)的菌種分類。Oliveira等首次將基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜術(shù)(MALDI-TOF-MS)用于鑒定孢子絲菌各隱含種，并指出通過蛋白質(zhì)譜分析可準(zhǔn)確、快速鑒定6個(gè)菌種[12]。近期滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)被用于孢子絲菌不同菌種間的鑒定，研究表明其特異性和敏感性均較高[13]。孫田等利用聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫法(PCR-ELISA)篩選與孢子絲菌結(jié)合效率相對(duì)較高的探針，結(jié)果顯示探針U26852、U26866、U26866、M85053及AF117945均位于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列上，而U26852顯色最強(qiáng)，EI 值最高，由此推斷探針U26852的結(jié)合效率相對(duì)較高[14]。

2　基因組學(xué)

2.1結(jié)構(gòu)基因組學(xué)Tateishi等對(duì)8株日本臨床S.schenckii進(jìn)行染色體核型分析顯示S.schenckii基因組全長約28 Mbp，包含6～8條染色體，每條長度為460到6 200 kb，而Torres-Guerrero對(duì)不同地理來源菌株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其基因組全長約45 Mbp[15]，這種差異可能由實(shí)驗(yàn)菌株為不同隱含種或研究方法不同引起。近期Teixeira等通過比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)S.schenckii和S.brasiliensis在基因組長度、轉(zhuǎn)座子、線粒體基因等方面存在差異[16]。前者基因組含17條染色體，全長32.3 Mb，后者含20條染色體，全長33.2 Mb；轉(zhuǎn)座子分別由0.34%和0.62%基因組構(gòu)成；線粒體基因組比較顯示編碼歸巢核酸內(nèi)切酶的內(nèi)含子只存在于巴西孢子絲菌。而雙向基因組對(duì)比顯示兩者染色體序列相似性高達(dá)97.5%；基因組進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)隱含種均大約在3.8～4.9萬年前開始分化，推斷為最近的一次物種形成事件；兩者基因組中與植物腐爛相關(guān)的多糖裂解酶基因缺乏表明孢子絲菌從植物致病性向動(dòng)物致病性的進(jìn)化演變。

2.2功能基因組學(xué)袁立燕等利用BLASTx等生物學(xué)軟件對(duì)S.schenckii的cDNA中編號(hào)為Locus-168-Contig-1的序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該基因與亞精胺合成酶基因同源，全長1 062 bp，可編碼291個(gè)氨基酸；編碼蛋白疏水性高，為非分泌型蛋白，無質(zhì)體、線粒體等定位序列及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；并成功克隆全長編碼區(qū)基因和構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒[17]。采用同樣方法翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)的cDNA全長序列被獲得，其結(jié)構(gòu)及功能、潛在抗原表位被預(yù)測(cè)出，為進(jìn)一步研究該蛋白生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)[18]。通過RNA干擾技術(shù)將孢子絲菌鈣/鈣調(diào)蛋白激酶1基因表達(dá)抑制后菌株在35 ℃環(huán)境下生長抑制表明該基因與菌株耐熱性相關(guān)；通過基因敲入，可表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的孢子絲菌已成功構(gòu)建，為研究孢子絲菌蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)提供了新技術(shù)[19]。Rodriguez-Caban等通過RAN干擾和酵母雙雜交技術(shù)明確了HSP90與鈣/鈣調(diào)蛋白激酶1在孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換中的相互作用[20]。王曉慧等通過簡并PCR結(jié)合RACE技術(shù)成功克隆S.schenckii的未知過氧化氫酶基因并將其命名為Sscat，為深入研究該基因結(jié)構(gòu)及其功能、蛋白質(zhì)表達(dá)奠定了基礎(chǔ)[21]。

3　發(fā)病機(jī)制

孢子絲菌病的發(fā)病機(jī)制與病原體毒力和宿主免疫狀態(tài)密切相關(guān)。毒力和宿主免疫狀態(tài)的分子生物學(xué)研究能夠揭示疾病的發(fā)生發(fā)展過程，為孢子絲菌病治療提供新靶點(diǎn)。

3.1病原體毒力孢子絲菌毒力主要與色素、黏附力及耐過氧化物能力等相關(guān)。孢子絲菌菌絲相和酵母相均可生成色素，包括1,8二羥基萘黑色素、真黑色素、膿褐素。研究發(fā)現(xiàn)分生孢子的黑化作用能夠抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬[22]，此外Madrid等分別用黑化和白化孢子絲菌感染小鼠發(fā)現(xiàn)前者僅在接種部位形成肉芽腫樣皮損，而后者形成多病灶性皮損，因此推斷色素可能與病原體播散相關(guān)[23]。孢子絲菌粘附素通過與纖連蛋白、層粘連蛋白和Ⅱ型膠原蛋白結(jié)合粘附宿主，兩個(gè)生長時(shí)相均可表達(dá)粘附素，但酵母相粘附細(xì)胞外基質(zhì)的能力更強(qiáng)[24]。Ruiz-Baca等首次通過二維凝膠電泳和免疫印跡法對(duì)S.schenckii的免疫原性蛋白進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)70 kDa糖蛋白(Gp70)是2個(gè)生長時(shí)相均存在的主要細(xì)胞壁抗原[25]，而Gp60主要存在于酵母相[26]。研究顯示Gp70是重要的粘附素，參與病原體入侵宿主的過程。轉(zhuǎn)化生長因子β1可增加內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)的暴露誘導(dǎo)孢子絲菌黏附內(nèi)皮單層而經(jīng)內(nèi)皮遷移，在免疫功能受損患者中易致播散型孢子絲菌病[27]。近期研究發(fā)現(xiàn)S.brasiliensis的耐過氧化物能力較S.schenckii更強(qiáng)[28]，計(jì)算機(jī)模擬分析推斷這種差異可能與氧化應(yīng)激信號(hào)通路中類似AP-1的轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)和Hog1基因突變有關(guān)。致病性相關(guān)蛋白的研究目前甚少，機(jī)體感染孢子絲菌6周后，孢子絲菌細(xì)胞壁的糖肽復(fù)合物能夠抑制宿主免疫反應(yīng)，被認(rèn)為與真菌致病性相關(guān)[19]；從S.schenckii酵母相提取抗原過程中可水解人IgG的分泌蛋白被發(fā)現(xiàn)，該蛋白可能參與孢子絲菌抗宿主的免疫反應(yīng)[29]。3.2宿主免疫狀態(tài)病原體入侵后機(jī)體迅速作出防御反應(yīng)，包括固有免疫和特異性免疫，后者分為細(xì)胞免疫和體液免疫。補(bǔ)體系統(tǒng)可被孢子絲菌激活，特別是替代途徑激活后形成的膜攻擊復(fù)合物可溶解破壞真菌細(xì)胞壁[16]。研究發(fā)現(xiàn)酵母相細(xì)胞壁模式識(shí)別受體Toll樣受體4(TLR4)即CD284可促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子釋放和氧化物質(zhì)如NO的生成[30]；Negrini等通過構(gòu)建感染孢子絲菌的TLR2缺陷小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞吞噬功能受損，并且促炎性細(xì)胞因子分泌水平明顯降低[31]，可見TLRs在孢子絲菌固有免疫中扮演著重要角色[30-32]。參與細(xì)胞免疫的細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。Uenotsuchi等運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)分離自皮膚的S.schenckii可快速激活單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(MoDCs)引起Th1細(xì)胞分泌大量IFN-γ參與反應(yīng)，而分離自內(nèi)臟的S.schenckii僅激活少量MoDCs和Th1細(xì)胞，有絲分裂原激活蛋白激酶P38和c-Jun氨基末端激酶信號(hào)通路被認(rèn)為參與該反應(yīng)過程[33]。研究發(fā)現(xiàn)孢子絲菌分生孢子可激活肥大細(xì)胞釋放大量TNF-α和IL-6，而復(fù)合物48/80可誘導(dǎo)加強(qiáng)分生孢子刺激肥大細(xì)胞釋放組胺，此外該細(xì)胞的功能消耗能夠顯著降低皮損程度[34]。Kajiwara等用孢子絲菌感染NADPH氧化酶和抗氧化酶缺陷的肉芽腫樣疾病(chronic granulomatous disease，CGD)小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)CGD小鼠不能清除接種部位真菌導(dǎo)致系統(tǒng)播散而死亡，由此可見NADPH氧化酶缺乏可致孢子絲菌致命性的感染，同時(shí)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的超氧陰離子及其代謝產(chǎn)物如活性氧、活性氮在抑制和殺滅真菌中起著重要作用[35-36]。感染孢子絲菌5到6周后，Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4啟動(dòng)機(jī)體體液免疫，體外實(shí)驗(yàn)中抗神經(jīng)鞘糖脂類抗原的抗體可阻礙孢子絲菌的生長及分化[37]。Nascimento等研究發(fā)現(xiàn)感染孢子絲菌的小鼠可產(chǎn)生抗Gp70的特異性IgG3和IgG1抗體，可能與機(jī)體清除病原體有關(guān)[38]，而近期研究認(rèn)為被動(dòng)免疫抗Gp70的抗體可保護(hù)小鼠免遭孢子絲菌感染[39]。

4　結(jié)　語

近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)孢子絲菌有了更深入認(rèn)識(shí)。生物學(xué)技術(shù)的運(yùn)用在基因?qū)用嫔蠈?shí)現(xiàn)了對(duì)孢子絲菌的菌種鑒定，但因技術(shù)要求較高，僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，探索臨床快速鑒定菌種和早期診斷疾病的方法仍是目前研究熱點(diǎn)。孢子絲菌基因組DNA由30萬左右個(gè)堿基組成，確定各部位結(jié)構(gòu)及功能已經(jīng)成為未來研究方向和目標(biāo)。同時(shí)明確發(fā)病機(jī)制，尋找新靶點(diǎn)在治療及預(yù)后判斷方面有重要指導(dǎo)意義。

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Advances on molecular biology ofSporothrixcomplex

HE Yu1, ZHAO Mi-mi1, YANG Zhi-bang2, ZHOU Xun1,3

(1.DepartmentofDermatology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.ExperimentalTeachingCenterforBasicMedicalPathogenBiologyandImmunologyLaboratoryofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;3.DepartmentofDermatologyandCosmetology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China)

Sporotrichosis is a polymorphic disease that affects both humans and animals worldwide caused by the fungal genusSporothrix. Sporotrichosis has been attributed to one single etiological agent,Sporothrixschencki, by morphological identification in the past decades. Recently, isolates received asSporothrixschenckiare regrouped with six cryptic species, and further research on molecular biology study on gene identification, genome and pathogenesis is helpful to understand the development and progression of Sporotrichosis, and has important significance on early diagnosis, treatment and prognosis. The present review will focus on recent advances on molecular biology ofSporothrixcomplex.

Sporothrix; gene identification; genome; pathogenesis; molecular biology

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31270062)

Zhou Xun, Email: zhouxun123@sina.com

周汛，Email：zhouxun123@sina.com

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016；3.重慶市中醫(yī)院皮膚美容科，重慶400021

R379

A

1002-2694(2016)06-0576-05

2015-12-04；

2016-02-15

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.013

國家自然科學(xué)基金(No.31270062)資助