史曉薇，郭　雄

(1.西安交大醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科,陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)環(huán)境與基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與公共衛(wèi)生學(xué)院地方病研究所，陜西 西安 710061)

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COL9A1基因多態(tài)性與兒童大骨節(jié)病的關(guān)聯(lián)分析

史曉薇1，郭雄2

(1.西安交大醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科,陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)環(huán)境與基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與公共衛(wèi)生學(xué)院地方病研究所，陜西 西安 710061)

[摘要]目的探討COL9A1(IX型膠原α1鏈)基因多態(tài)性在兒童大骨節(jié)病(Kashin-beck disease，KBD)發(fā)病中的作用。方法2015年6至8月西安交大醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院地病所在陜西省麟游縣和永壽縣大骨節(jié)病區(qū)收集35例KBD患兒(病例組)和84例健康兒童(對(duì)照組)全血，并提取全血基因組DNA，應(yīng)用Sequenom assARRAY RS1000分型技術(shù)對(duì)COL9A1上15個(gè)SNPs基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，比較病例組與對(duì)照組等位基因和基因型的分布差異。結(jié)果關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)rs6910140位點(diǎn)突變型等位基因C的頻率在病例組為17.1%(12/70)，明顯低于對(duì)照組的38.1%(64/168)(χ2=11.5，P<0.05)；而在位點(diǎn)rs1135056中，突變型等位基因C的頻率在病例組為32.9%(23/70)，明顯高于對(duì)照組的17.3%(29/168)(χ2=7.03，P<0.05)。兩位點(diǎn)的基因型頻率分布在兩組兒童中也均存在顯著性差異(χ2值分別為12.32和10.79，均P<0.05)。結(jié)論COL9A1基因多態(tài)性與兒童KBD的易患性有關(guān)，在rs6910140基因上個(gè)體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的降低有關(guān)，在基因rs1135056上個(gè)體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的增加有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]大骨節(jié)病；COL9A1基因；兒童；單核苷酸多態(tài)性

大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease，KBD)是一種地方性、多發(fā)性、畸形性骨關(guān)節(jié)病，至今原因未明。長(zhǎng)期以來認(rèn)為該病的深層軟骨細(xì)胞壞死是由環(huán)境有害因素所致[1-2]，曾提出環(huán)境化學(xué)學(xué)說(主要有硒缺乏學(xué)說)、糧食真菌毒素學(xué)說及飲水有機(jī)物中毒學(xué)說。但環(huán)境因素不能完全解釋病區(qū)的一些流行病學(xué)現(xiàn)象：如即使在患病最重的家庭并非所有人均患病等。近年來對(duì)KBD的發(fā)病特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，個(gè)體的易感性可能在KBD的發(fā)病中起一定的作用[3-4]。

KBD是以關(guān)節(jié)軟骨和骺板軟骨深層軟骨細(xì)胞發(fā)生壞死繼而導(dǎo)致軟骨發(fā)育障礙的慢性繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)病，是一種特殊類型的骨關(guān)節(jié)疾病，其中COL9A1基因是編碼IX型膠原的α1鏈，是透明軟骨中的主要膠原成份。研究表明IX型膠原基因突變與多種骨軟骨疾病有關(guān)[5-6]。COL9A1基因多態(tài)性與女性胯關(guān)節(jié)炎的易感性有關(guān)。另有報(bào)道表明，COL9A1基因第9外顯子的突變與先天性骨骺發(fā)育不良相關(guān)；但未見其多態(tài)性與兒童KBD易感性的報(bào)道。本研究首次通過對(duì)COL9A1基因多態(tài)性在KBD易感人群(兒童)中的關(guān)聯(lián)分析，探討COL9A1在KBD發(fā)病中的作用。

1研究對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

按照我國(guó)《大骨節(jié)病診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 207-2010)進(jìn)行KBD病例的診斷和排除。2015年6至8月西安交大醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院地病所對(duì)陜西省麟游縣和永壽縣大骨節(jié)病區(qū)的119例無親緣關(guān)系(非3代以內(nèi)親屬)的兒童進(jìn)行研究，其中包括35例KBD兒童(病例組)和年齡、性別相匹配的84例健康兒童(對(duì)照組)。所有研究對(duì)象均進(jìn)行臨床和右手正位X片檢查，均排除了其它骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病患者。在征得患者及家屬知情同意后抽取空腹靜脈血5mL。本研究得到了西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 SNPs基因分型

選擇COL9A1基因的15個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行研究，位點(diǎn)信息見表1；被選擇的SNPs位點(diǎn)在漢族人群中滿足r2>0.8和MAF(minor allele frequency)>0.1，全血基因組DNA提取用GoldMag純化試劑盒(陜西北美基因股份有限公司生產(chǎn))，DNA濃度檢測(cè)使用Thermo Fish公司的NaNoDrop 2000c完成。多重PCR引物利用美國(guó)Sequenom公司的Assay Design 4.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，SNPs分型檢測(cè)使用美國(guó)Sequenom公司的MassArrayRS1000飛行質(zhì)譜平臺(tái)，檢測(cè)數(shù)據(jù)由Sequenom公司的Typer 4.0軟件進(jìn)行管理和分析。

表1COL9A1基因的研究位點(diǎn)信息比較結(jié)果

Table 1The loci information of the studied SNP sin COL9A1 gene

注：a指野生型等位基因/突變性等位基因。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SNPs的各基因型頻率在對(duì)照組中行Hardy Weinberg(HWE)檢驗(yàn)[7]；采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)(超過20%格子理論頻數(shù)<5或者任何1格理論頻數(shù)<1時(shí))比較各位點(diǎn)的等位基因頻率/基因型頻率在兩組中的分布；以P<0.05為有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1被研究人群一般信息

本研究包括35例KBD兒童和84例年齡、性別匹配的健康兒童，兩組兒童性別構(gòu)成(男/女：17/18與42/42；χ2=0.02，P>0.05)和平均年齡(11.30±6.79歲與11.97±7.85歲；t=0.58，P>0.05)比較均無顯著性差異。35例病例組兒童包括32例Ⅰ期和3例Ⅱ期KBD患兒。

2.2 COL9A1基因15個(gè)多態(tài)性SNPs位點(diǎn)與大骨節(jié)病關(guān)聯(lián)性

本次研究中15個(gè)SNPs位點(diǎn)在84例正常兒童的HEW檢驗(yàn)結(jié)果見表1，P=0.14～0.93，均P>0.05，表明分型結(jié)果符合遺傳學(xué)定律。位點(diǎn)rs6910140和rs1135056等位基因(2個(gè)位點(diǎn)的野生型/突變型等位基因均為T/C)頻率在兩組兒童中均有顯著性差異(均P<0.05)。rs6910140位點(diǎn)等位基因C的頻率在病例組為17.1%(12/70)，明顯低于對(duì)照組的38.1%(64/168)，χ2=11.5，P<0.05。在位點(diǎn)rs1135056中，等位基因C的頻率在病例組為32.9%(23/70)，明顯高于對(duì)照組的17.3%(29/168)，χ2=7.03，P<0.05。位點(diǎn)rs6910140中病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為62.9%(22/35)、34.3%(12/35)和2.8%(1/35)與對(duì)照組的構(gòu)成比30.9%(26/84)、63.1%(53/84)和5.9%(5/84)比較有顯著性差異(χ2=12.32，P<0.05)。位點(diǎn)rs1135056中病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為34.3%(12/35)、62.9%(22/35)和2.8%(1/35)，與對(duì)照組的構(gòu)成比66.7%(56/84)、32.1%(27/84)和1.2%(1/84)比較有顯著性差異(χ2=10.79，P<0.05)。其余位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示COL9A1基因多態(tài)性與兒童KBD的易患性有關(guān)，在rs6910140基因上個(gè)體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的降低有關(guān)，在基因rs1135056上個(gè)體攜帶等位基因C可能與KBD易患性的增加有關(guān)。15個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因及基因型分布，見表2。

注：a野生型等位基因純合子/雜合子/突變型等位基因純合子。

3討論

3.1 COL9A1基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)病的易感性有關(guān)

大骨節(jié)病的病因不清，遺傳因素可能與個(gè)體的易感性有關(guān)[8]。KBD和關(guān)節(jié)炎(OA)有類似的病理學(xué)特征，如軟骨細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、金屬基質(zhì)蛋白退行性變化等。IX型膠原與骨關(guān)節(jié)疾病的關(guān)系已得到了專家的共識(shí)，COL9A1基因是編碼IX型膠原的α1鏈，COL9A1基因的多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)病的易感性有關(guān)。5～13歲兒童是KBD的易患人群，本文通過關(guān)聯(lián)分析，探討COL9A1基因多態(tài)性在KBD兒童發(fā)病中的作用。

3.2 COL9A1基因中的rs6910140和rs1135056多態(tài)性與兒童大骨節(jié)病易感性有關(guān)

本文對(duì)COL9A1基因上的15個(gè)SNPs位點(diǎn)在KBD兒童中的研究發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs6910140和rs1135056)與兒童KBD相關(guān)聯(lián)。在rs6910140位點(diǎn)病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為62.9%、34.3%和2.8%與對(duì)照組的構(gòu)成比30.9%、63.1%和5.9%比較有顯著性差異(P<0.05)，且突變型等位基因C的頻率在病例組為17.1%，明顯低于對(duì)照組的38.1%，對(duì)照組兒童攜帶C等位基因頻率高，說明在基因rs6910140上，個(gè)體攜帶C等位基因者，其KBD的易患性降低。在位點(diǎn)rs1135056中病例組兒童TT/TC/CC基因型的頻率為34.3%、62.9%和2.8%與對(duì)照組的構(gòu)成比66.7%、32.1%和1.2%比較有顯著性差異(P<0.05)，且突變型等位基因C的頻率在病例組為32.9%，明顯高于對(duì)照組的17.3%，病例組兒童攜帶C等位基因頻率高，說明在基因rs1135056上，個(gè)體攜帶C等位基因者，其KBD的易患性增加。本次研究結(jié)果支持COL9A1基因多態(tài)性與KBD易患性有關(guān)。目前位點(diǎn)rs6910140和rs1135056多態(tài)性在骨關(guān)節(jié)病中作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，推測(cè)其與改變了a1(IX)蛋白表達(dá)的導(dǎo)致軟骨退行性改變與KBD的發(fā)病有關(guān)。a1(IX)在KBD患者骨關(guān)節(jié)中表達(dá)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，COL9A1基因多態(tài)性與兒童KBD易患性有關(guān)，當(dāng)然這些結(jié)論有待于今后在其它人群和較大樣本量中研究驗(yàn)證。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：潘凱麗]

Association study of polymorphism of COL9A1 gene and the risk of Kashin-Beck disease in children

SHI Xiao-wei1, GUO Xiong2

(1.Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Medical Collage, Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China;2. Faculty of Public Health, Ministry of Education Key Laboratory of Environment and Genes Related to Disease,Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

[Key words]Kashin-Beck disease (KBD); COL9A1 gene; children; single nucleotide polymorphism

[Abstract]Objective To investigate the role of α1 of type IX collagen gene (COL9A1) in the pathologenesis and progression of Kashin-Beck disease (KBD) in children. Methods Genomic DNA of whole blood was collected from 35 KBD cases (case group) and 84 healthy children (control group) in Linyou County and Yongshou County of Shaanxi Province where faculty of public health of Xi’an Jiaotong University was from June to August in 2015. Fifteen SNPs in COL9A1 genotypes were conducted using Sequenom assARRAY RS1000. The frequencies of alleles and genotypes were compared between two groups. Results The allele frequency of mutant allele C in rs6910140 was 17.1% (12/70) in case group, which was significantly lower than 38.1% (64/168) in control group (χ2=11.5,P<0.05). But in locus rs1135056, the allele frequency of mutant allele C was 32.9% (23/70), which was higher than 17.3% (29/168) in control group (χ2=7.03,P<0.05). The frequencies of the genotype in two loci were significantly different in two groups (χ2value was 12.32 and 10.79, respectively, bothP<0.05). Conclusion Polymorphism of COL9A1 gene is associated with the liability of KBD in children. The subjects carrying allele C in rs6910140 have lower risk of KBD but those carrying allele C in rs1135056 have higher risk of KBD.

[收稿日期]2016-03-25

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81273007)

[作者簡(jiǎn)介]史曉薇(1971-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事兒童保健的研究。

[通信作者]郭雄，教授。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.05.002

[中圖分類號(hào)]R684.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5293(2016)05-0556-02