翟姍姍綜述，樊朝美審校

綜述

基因檢測在肥厚型心肌病診斷、治療及預(yù)后評估的應(yīng)用進(jìn)展

翟姍姍綜述，樊朝美審校

肥厚型心肌?。℉CM）是由編碼心肌肌小節(jié)蛋白的基因突變所導(dǎo)致的最常見的遺傳性心臟病，其主要特點為無繼發(fā)原因的左心室肥厚，發(fā)病率大約 1/500，亦是青少年和運動員心原性猝死（SCD）的最常見原因。隨著二代測序技術(shù)在HCM疾病相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，基因檢測在疾病早期診斷、治療及預(yù)后方面的作用日益顯著，本文分別從基因檢測技術(shù)的進(jìn)展及該進(jìn)展在診斷與鑒別診斷、探討異質(zhì)性機(jī)制、開展新型藥物、評估不同預(yù)后及優(yōu)生優(yōu)育等各方面進(jìn)行闡述。

綜述；心肌病，肥厚型；基因

肥厚型心肌?。℉CM）是指并非完全因心臟負(fù)荷異常引起的，以室壁厚度增加為表現(xiàn)的遺傳性心肌病[1]，亦是青少年及運動員心原性猝死（SCD）的主要原因，盡早診斷、治療尤為重要。基因檢測有助于HCM的早期診斷，但一代測序技術(shù)的低檢出率及高成本限制了其在臨床中的應(yīng)用，近年來二代測序技術(shù)（NGS）的廣泛應(yīng)用彌補了一代測序技術(shù)的不足。本文就基因檢測在HCM診斷、治療及預(yù)后評估的應(yīng)用進(jìn)展做一綜述。

1 基因檢測技術(shù)的進(jìn)展

傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)，因其成本高、速度慢以及序列少等缺點，已不能滿足深度測序和重復(fù)測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求。所以，以高通量為特點的NGS應(yīng)運而生，不再需要大腸桿菌進(jìn)行體內(nèi)擴(kuò)增，而是直接通過聚合酶或者連接酶進(jìn)行體外合成測序，可快速并低成本地獲得大規(guī)模DNA序列信息。NGS主要分為三類：（1）靶向基因測序（Target-NGS）是對特定疾病的所有已知致病基因進(jìn)行測序，主要用于診斷；（2）全外顯子測序（WES）是對基因所有編碼區(qū)進(jìn)行測序，多在Target-NGS無法測得突變時，用于明確可疑遺傳性疾病的致病突變；（3）全基因組測序（WGS）是指對全基因組30億bp DNA測序，包括編碼區(qū)及非編碼區(qū)，主要是用來明確新發(fā)致病基因與疾病的關(guān)系[2]。

值得注意的是，NGS亦存在以下不足：（1）高通量的實現(xiàn)以犧牲序列片段為代價，NGS測序長度為400 bp，小于一代測序的1000 bp，NGS序列長度的減少使得基因組或轉(zhuǎn)錄組的后續(xù)拼接較一代測序差，致其錯誤率偏高，故目前NGS測序后的結(jié)果仍需應(yīng)用一代測序如Sanger法驗證；（2）NGS采用體外擴(kuò)增的辦法，樣品處理須經(jīng)過多重步驟，步驟的增加引入各種誤差，可能導(dǎo)致假陽性率較高；（3）NGS所得的海量數(shù)據(jù)是科研工作者面對的更大的挑戰(zhàn)，如何充分挖掘隱藏在原始數(shù)據(jù)中的生物學(xué)意義并解釋相應(yīng)生物學(xué)現(xiàn)象是一大難題，如肌聯(lián)蛋白這一基因突變的HCM致病性較難分辨確認(rèn)，因為約有3%的正常人可能攜帶該基因突變[3]。

綜上所述，鑒于NGS測序步驟及結(jié)果的復(fù)雜性，建議心臟病學(xué)家、基因遺傳學(xué)家及基因咨詢學(xué)家等多學(xué)科共同合作分析、解釋測序結(jié)果并向患者及其家屬提供適當(dāng)建議[3]。

2 基因檢測在HCM診斷與鑒別診斷中的作用

HCM基因檢測最初僅限于實驗室研究，現(xiàn)在主要用于HCM的診斷與鑒別診斷[4]。隨著NGS在HCM中的廣泛應(yīng)用，不僅能夠檢出罕見的肌節(jié)蛋白突變及非肌節(jié)蛋白突變[5]，還能夠發(fā)現(xiàn)大片段DNA的拷貝數(shù)變異（ CNV）、倒位（inversion）和平衡易位（balanced translocation）等結(jié)構(gòu)變異（SV），以及表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化水平和組蛋白修飾因子的改變，探討這些結(jié)果的臨床意義將有助于解釋HCM的異質(zhì)性及預(yù)后。NGS還可檢出非HCM致病突變?nèi)鐦蛄５鞍淄蛔?、離子通道蛋白突變，另外NGS亦可檢出擬表型基因突變。如，F(xiàn)abry病的α半乳糖苷酶基因（GLA）突變，這有助于HCM的鑒別診斷。

3 基因檢測有助于解釋HCM的異質(zhì)性

HCM異質(zhì)性突出是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)。HCM患者可無癥狀，也可早期發(fā)生SCD，有研究表明這種異質(zhì)性可能受以下因素的影響：（1）致病基因不同；（2）致病突變所累及氨基酸位置不同；（3）修飾因子的影響。

HCM的致病基因突變可能與心室形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)：早期研究提示HCM的室間隔呈反向曲線形者較乙狀形者的突變陽性率更高（79% vs 8%）。Bos等[6]發(fā)現(xiàn)其原因在于反向曲線形肥厚的HCM患者多為肌節(jié)蛋白基因突變所致，乙狀形肥厚的HCM患者多為Z盤基因突變所致，而最初應(yīng)用一代測序的基因僅包括肌節(jié)蛋白基因并無Z盤基因，所以出現(xiàn)反向曲線形者突變陽性率高這一結(jié)論。Lopes等[7]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜錨蛋白基因（ANK2）突變的HCM患者，其最大室間隔厚度較其他基因型明顯增加。最近的HCM基因型與心臟磁共振成像對照研究表明，局灶性心肌纖維化在基因型陽性者中較陰性者多見，而彌漫性心肌纖維化在基因型陰性者中較基因陽性者多見[8]。以上研究初步提示，特定的基因突變與HCM心室形態(tài)結(jié)構(gòu)可能有相關(guān)性。

HCM與其他遺傳性心肌病的致病基因突變重疊和并存：Haas等[9]應(yīng)用Target-NGS發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型心肌?。―CM）、HCM、離子通道心肌病等致病突變的重疊比例較高。Schaefer等[10]對一個6個月大小猝死的左心室致密化不全患者進(jìn)行NGS測序分析，發(fā)現(xiàn)其攜帶肌球蛋白結(jié)合蛋白C（MYBPC3）雙復(fù)合突變 （Lys505del、Pro955fs）。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)，同一個家系中同時存在兩種以上遺傳性心肌病的致病基因突變，如Wang等[11]對一HCM合并長QT綜合征（LQT）的家系進(jìn)行基因檢測，發(fā)現(xiàn)該家系同時存在LQT1與HCM致病突變。對SCD高危人群的基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其多突變比例較多[12]。隨著NGS在臨床中的進(jìn)一步應(yīng)用，有可能發(fā)現(xiàn)更多不同心肌病之間致病基因的重疊以及并存的現(xiàn)象，這有可能是遺傳性心臟病異質(zhì)性顯著的一個重要原因。

目前關(guān)于基因型-表型的關(guān)系仍無定論，相信大樣本多中心HCM基因型隨訪研究的開展，將有助于揭示基因型-表型的關(guān)系。

4 基因檢測在HCM治療中的作用

4.1 藥物治療的新視點

藥物、酒精消融術(shù)及手術(shù)治療可以改善HCM患者的癥狀并提高生活質(zhì)量。但并不能夠逆轉(zhuǎn)已病變的心肌，亦不能改善HCM患者的長期預(yù)后。針對以上問題，新開展了一些藥物的探索性動物研究，并發(fā)現(xiàn)氯沙坦、辛伐他汀、螺內(nèi)酯以及抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸等可以減輕HCM小鼠心肌纖維化程度和減少膠原成分，而以上小鼠均是某種特定HCM致病突變轉(zhuǎn)基因所建立的動物模型。因此，將來基因檢測結(jié)果可以指導(dǎo)特定致病基因突變的HCM治療[3]。亦有研究表明在MYH7-Arg403Gln或MYH7-Arg719Trp轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生左心室肥厚前，分別給予地爾硫卓、氯沙坦，可以減輕心肌纖維化程度并延緩左心室肥厚的進(jìn)程[3]。

現(xiàn)今，HCM的早期干預(yù)臨床研究相對較少，近期有人將HCM基因型陽性攜帶者隨機(jī)分為地爾硫卓治療組與安慰劑組，2年后發(fā)現(xiàn)地爾硫卓治療組左心室壁厚度及質(zhì)量、舒張期充盈和心肌肌鈣蛋白I水平均較安慰劑組有所改善[13]。相信隨著基因型陽性攜帶者的大規(guī)模隨訪隊列研究的增多，將能明確HCM的早期干預(yù)是否有益。

4.2 組織工程和再生醫(yī)學(xué)

HCM新藥的開發(fā)與設(shè)計受到兩方面制約：（1）缺少能夠精準(zhǔn)體現(xiàn)HCM病理生理的體外模型；（2）業(yè)已建立的小鼠動物模型與人類基因組存在一定差異。所以，應(yīng)用類似于正常心肌結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)的仿生成分和可分化為HCM心肌細(xì)胞的多能干細(xì)胞進(jìn)行研究，不僅可以加深對HCM發(fā)病機(jī)制、基因型與表型相關(guān)性的理解，而且還可行特異突變HCM的藥物研究，達(dá)到精準(zhǔn)治療目的[14]。

心臟再生工程中成纖維細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為正常心肌細(xì)胞對于HCM的治療尤為重要。如果在HCM發(fā)病早期就能夠成功逆轉(zhuǎn)左心室肥厚，就可以減少心肌纖維化、延緩病程、減少SCD，盡管這種逆轉(zhuǎn)可以實現(xiàn)，但其技術(shù)難度大、成功率低。納米技術(shù)的出現(xiàn)將有效改進(jìn)該逆轉(zhuǎn)過程，它可攜帶包含逆轉(zhuǎn)所需miRNA和轉(zhuǎn)錄因子的載體靶向定位于HCM患者的成纖維細(xì)胞并促其逆轉(zhuǎn)，從而達(dá)到治療目的。此外，納米技術(shù)憑借其高濃度、高選擇性、高通透性、高聯(lián)合性等四大優(yōu)勢，不僅可將特異藥物運送到靶向細(xì)胞，還可運送特異的基因，可用于研究HCM特異基因致病機(jī)制及相應(yīng)治療方案。

5 基因檢測在預(yù)后評估中的作用

5.1 基因檢測可否確定良性與惡性突變

早期研究認(rèn)為肌鈣蛋白T（TNNT2）、β肌球蛋白重鏈（MYH7）為“惡性突變”， MYBPC3為“良性突變”，以上均為家族性HCM研究，隨后大樣本散發(fā)HCM研究發(fā)現(xiàn)上述結(jié)論并不成立。 MYBPC3與MYH7型HCM在發(fā)病年齡、室壁厚度、外科手術(shù)比例及猝死家族史等方面并無差異， 隨后Page等[15]也發(fā)現(xiàn)MYBPC3并非均晚期發(fā)病、預(yù)后好，這類基因型的HCM臨床表型仍存在極大異質(zhì)性，故不能認(rèn)為MYBPC3屬于“良性突變”。 TNNT2基因型的大樣本隊列研究發(fā)現(xiàn)該突變患者的心血管死亡風(fēng)險與正常人群無異，將其認(rèn)為是“惡性突變”亦不合理[16]。

盡管，某種特定致病基因與預(yù)后的明確相關(guān)性仍無定論，但大多數(shù)研究認(rèn)為HCM基因型陽性者比基因型陰性者的預(yù)后差[7]，基因型陽性者發(fā)病年齡更早、更易發(fā)展為心力衰竭、SCD家族史更為多見、非對稱性左心室肥厚比例較多、左心室肥厚程度和心血管死亡風(fēng)險更重。HCM的良、惡性基因之分還存在很多爭議，尚不能單純依據(jù)基因測序來決定HCM的預(yù)后，仍需用傳統(tǒng)臨床危險分層指標(biāo)來識別SCD高風(fēng)險患者。

5.2 多突變與預(yù)后的關(guān)系

即使在沒有傳統(tǒng)SCD危險因素時，多突變HCM患者的惡性心律失常、SCD、左心室極度肥厚、終末期心力衰竭的發(fā)生率等心血管死亡風(fēng)險均較單基因突變的HCM患者明顯升高[17]。隨著NGS的應(yīng)用，HCM雙突變率從一代測序技術(shù)所發(fā)現(xiàn)的5%上升到38% ，三突變或更多突變達(dá)12.8%[9]。Girolami等[18]提出多突變HCM的臨床表型加重為基因劑量效應(yīng)所致，即兩種或以上異?；蜻^度表達(dá)疊加產(chǎn)生的效應(yīng)。但另有研究表明基因突變之間存在相互作用，雙突變或多突變在HCM中的致病機(jī)制并非為單純的劑量疊加，而是第二個突變與第一個突變相互作用從而加重表型[19]。多突變引起表型加重的機(jī)制需在分子、細(xì)胞、動物實驗中進(jìn)一步分析，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鈣離子通道調(diào)節(jié)基因表達(dá)下調(diào)以及轉(zhuǎn)錄因子STAT-3的上調(diào)與雙突變致病性加重相關(guān)[12]，這一發(fā)現(xiàn)對今后的研究將有極大幫助。

6 基因檢測與家系篩查

先證者家系成員基因篩查的前提是先證者的致病突變已明確，值得注意的是，采用一代測序技術(shù)能夠明確突變的先證者僅占50%，而且其中很多突變致病性質(zhì)未明。因此，僅有有限的先證者家系可以進(jìn)行基因篩查。NGS則可以顯著提高HCM先證者致病突變檢出率，并顯著降低先證者家系基因篩查成本?，F(xiàn)在基因篩查的主要應(yīng)用目的為在家族性HCM的家系成員中篩查出基因型陰性的成員并告知其無發(fā)病可能，減少其心理負(fù)擔(dān)和不必要的長期隨訪。但是，HCM的“無罪宣告”需特別謹(jǐn)慎。同時必須向基因型陰性的成員告知如有不適，也需及時就診。究其原因歸為以下四點：（1）既往認(rèn)為無或不確定致病性的突變有可能為致病突變;（2）先證者可能為多突變，而使用一代測序技術(shù)的基因篩查僅進(jìn)行單個突變的篩查，遺漏了第2個或第3個致病突變; （3）實驗室等因素的人為錯誤;（4）原始突變，初期先證者并無突變，子代新生的原始突變?？傊琀CM家系成員基因篩查的應(yīng)用看似容易，但其結(jié)果的解釋與建議需要多學(xué)科合作方能最優(yōu)化。

7 基因檢測與優(yōu)生優(yōu)育

產(chǎn)前遺傳診斷是指在妊娠初期對患者外周血、羊水及臍帶血等進(jìn)行基因檢測，有助于早期發(fā)現(xiàn)胎兒是否攜帶致病基因，但是該方法除在檢測時機(jī)、準(zhǔn)確性、安全性諸多方面仍存在問題外，如何處理基因型陽性攜帶者還存在醫(yī)學(xué)倫理問題。因為并非所有致病基因攜帶者在其一生中均會出現(xiàn)臨床表型。產(chǎn)前遺傳診斷在大部分國家非合法，其他手段如收養(yǎng)、人工授精、使用捐贈的配子以及胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）等有助于優(yōu)生優(yōu)育。其中，PGD是一種用于阻斷遺傳性疾病的新興技術(shù)，它是經(jīng)體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)獲得的多個受精卵，在體外培養(yǎng)至8～10細(xì)胞期的胚胎卵裂球時，移出1～2個卵裂球進(jìn)行PCR或FISH檢測，篩選掉其中攜帶致病突變的胚胎卵裂球，僅移植未攜帶致病突變的遺傳型正常的胚胎。這種方法的優(yōu)點是體外培養(yǎng)的達(dá)到6～8細(xì)胞期的卵裂球都被認(rèn)為是全能的，1個或2個卵裂球的移去不會影響胚胎的進(jìn)一步發(fā)育。該技術(shù)不僅避免出生遺傳性疾病胎兒，還可使因為遺傳問題而不能生育的夫婦順利生育健康嬰兒，PGD 明顯優(yōu)于傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法。隨著單細(xì)胞分子生物學(xué)檢測手段的不斷完善， 對更多的遺傳性疾病進(jìn)行PGD已成為可能。近期Kuliev等[20]對9組遺傳性心肌病的夫妻行PGD，明確了其在遺傳性心肌病中應(yīng)用的優(yōu)勢及安全性，尤其是對有青年SCD、植入型心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器（ICD）、室性心動過速、心臟移植等家族史的夫妻有很大幫助，達(dá)到遺傳性心臟病的生殖阻斷目的。

8 總結(jié)與展望

基因檢測有助于HCM早期診斷，二代測序技術(shù)不僅能提高致病突變檢出率與經(jīng)濟(jì)效益比值，還可發(fā)現(xiàn)新發(fā)的致病突變及突變形式，并進(jìn)一步揭示基因型與表型的關(guān)聯(lián)性。基因檢測在評價HCM預(yù)后及優(yōu)生優(yōu)育方面亦有幫助，多突變有可能是HCM患者SCD危險因素之一。盡管心臟組織工程、再生醫(yī)學(xué)、納米技術(shù)處于起步階段，但聯(lián)合研究將有助于了解HCM的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的藥物。

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（編輯：王寶茹）

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項-《心血管創(chuàng)新藥物臨床研究技術(shù)平臺建設(shè)》（2012ZX09303-008-001）；2010年國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目-《衛(wèi)生部重點實驗室項目》

100037 北京市，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院 衛(wèi)生部心血管藥物臨床研究重點實驗室

翟姍姍 博士 主要從事肥厚型心肌病相關(guān)研究 Email:shan02shan09@163.com 通訊作者：樊朝美 Email:fred_fan2004@aliyun.com

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1000-3614（2016）11-1136-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.11.021

（2016-03-06）