李昆朋

（山東省青州市畜牧局，山東青州 262500）

傳染性支氣管炎病毒活疫苗毒株在禽流感病毒H9N2毒株感染過程中的協(xié)同作用

李昆朋

（山東省青州市畜牧局，山東青州 262500）

H9N2亞型禽流感病毒已成為威脅我國商品雞健康的重要因素，本研究調(diào)查研究了H9N2禽流感病毒和傳染性支氣管炎病毒疫苗株H120的混合感染，混合感染組的發(fā)病率60%和死亡率6%，顯著高于H9N2的單獨感染組3%和0%，而且混合感染組的排毒時間高于單獨感染組，提示傳染性支氣管炎病毒能夠增強H9N2禽流感病毒在體內(nèi)的增值。本研究旨在探索IBV活疫苗是否對H9N2毒株感染起到協(xié)同作用。

H9N2亞型禽流感病毒 傳染性支氣管炎疫苗 試驗方法 結(jié)果

1 材料

1.1 病毒

禽流感病毒（AIV）A /CK/SD/qd/ 2012（H9N2）和商用傳染性支氣管炎疫苗。

1.2 實驗動物

9日齡SPF雞胚、1日齡SPF白來航雞。

1.3 所用試劑

1.3.1 生理鹽水：4.5g NaCl溶于400ml水中，定容至500ml，室溫保存。

1.3.2 PBS（0.01M），pH 7.3

1.3.3 含三抗的PBS（10，000IU/ml）

1.3.4 Alsever液

1.3.5 1 %雞紅血球：健康雞翅下靜脈采血，用Alsever液作為抗凝劑，然后加入滅菌的生理鹽水洗滌，2，000rpm離心10min，除去上清及中間白細胞層，重復(fù)以上操作2次。最后2，500rpm離心15min，量取紅細胞泥，用生理鹽水做100倍稀釋，配制成1%的雞紅細胞懸液，4℃保存。

2 方法

通過紅細胞凝集試驗（HA）和紅細胞凝集抑制試驗（HI）結(jié)果以++++、+++、++、+和-表示。結(jié)果判定以++為終點。依此標準判定：以能夠抑制病毒凝集紅細胞的最大血清稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價。判定HI效價大于或等于8的血清樣本為H9亞型流感病毒抗體陽性（Palmer D. F. et al.，1975）。

2.1 病毒的繁殖及EID50的測定

2.1.1 病毒的繁殖

取含病毒尿囊液接種10日齡SPF雞胚（0.2ml/枚），35℃下孵育48h，棄去24h內(nèi)死胚，將24～48h內(nèi)死亡和存活雞胚置4℃冰箱過夜或-20℃冷凍40min，無菌收獲尿囊液，測定其血凝效價，將有效價的新鮮尿囊液分裝，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 EID50的測定

按常規(guī)方法測定雞胚半數(shù)感染量（EID50），進行病毒滴定。取病毒懸液作10倍倍比稀釋，從10-1稀釋到10-10，稀釋液為PBS，從10-4～10-10每個稀釋度接種5枚雞胚（0.1ml/枚），35℃孵育48h，將雞胚于4℃過夜，收獲尿囊液，測定其血凝效價，按Reed-Muech法計算半數(shù)感染量：

EID50=高于50%感染率的病毒稀釋度對數(shù)+相應(yīng)距離比×稀釋系數(shù)的對數(shù)（10倍遞進稀釋為1）

2.2 雞的致病性試驗

2.2.1 動物分組

120只1日齡SPF雛雞隨機分為A、B、C、D四組，每組單獨飼養(yǎng)與四個隔離器中，給予相同的飼養(yǎng)條件。

2.2.2 攻毒途徑與劑量

21日齡時，A組雛雞通過滴鼻接種106EID50 H9N2 AIV；B組通過滴鼻接種一個劑量的IBV疫苗；C組通過滴鼻接種106EID50 H9N2 AIV和一個劑量的IBV；D組接種磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）為陰性對照組。實驗中不接種其他疫苗，每天監(jiān)測雞的一般狀況，臨床癥狀，排毒情況和死亡率。

2.2.3 病變觀察雞病毒的分離與測定

在整個實驗中，觀察實驗組雞只臨床變化。分別于攻毒后第3、5、7、9、11d采集各組攻毒組雞只的咽拭子、泄殖腔拭子進行病毒分離。在攻毒后第3、5、7d剖殺各組攻毒組雞只5只，采集肺、腎、脾、肝、腦、十二指腸，每個組織取部分用10%福爾馬林生理鹽水固定液進行固定備用，剩余的組織進行病毒分離和滴定。各組織稱量后，按照1：4（W/V）的比例加入含雙抗的冷PBS，采集咽拭子和泄殖腔拭子所用PBS的抗生素濃度為10，000IU/ml，其病毒分離和滴定程序同上。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥狀

接種病毒前，對所有群體的日常監(jiān)測結(jié)果表明，所有的雞臨床正常，沒有發(fā)現(xiàn)任何的異常。A組單獨接種H9N2 AIV組出現(xiàn)輕微一過性臨床癥狀，有兩只雞稍微有點乍毛。B組單獨接種IBV H120疫苗組，無明顯的臨床癥狀。C組H9N2 AIV+ IBV H120組在攻毒后出現(xiàn)明顯的精神抑郁、張口喘、羽毛亂等臨床癥狀，并有雞死亡。D組生理鹽水對照組無任何臨床癥狀。

3.2 發(fā)病率統(tǒng)計

每天對四組SPF雞分別觀察至攻毒后第15d，觀察并記錄各組發(fā)病雞的數(shù)量和發(fā)病嚴重程度，計算發(fā)病率主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，同時精神萎靡，乏力蹲坐。

3.3 剖檢變化

死亡雞的呼吸系統(tǒng)尸檢發(fā)現(xiàn)死后檢查顯示氣管充血，肺充血、滲出，在氣管分叉管型形成，延伸到下支氣管。

禽流感病毒+ IBLV接種組死雞中形成氣管分叉管型（箭）延伸到支氣管。

3.4 排毒時間統(tǒng)計

H9N2 AIV單獨感染組喉頭的排毒高峰期在感染后3～5d；泄殖腔僅在攻毒后3d檢測到病毒。而混合感染組無論是喉頭還是泄殖腔的排毒水平和排毒時間均高于單獨感染組。兩組喉頭的排毒水平均高于泄殖腔。與H9N2 AIV單獨感染相比，混合感染對H9N2 AIV喉頭的排毒周期無明顯影響；但明顯延長了泄殖腔的排毒周期。

4 討論

從以上實驗結(jié)果分析，H120顯著增強了H9N2 AIV在各器官的定植和繁殖能力。H9N2 AIV和其他病原微生物之間存在協(xié)同致病的作用；H120疫苗株和H9N2 AIV 是導(dǎo)致支氣管干酪樣栓子的形成的重要病因。已有研究表明，冠狀病毒IBV能夠編碼類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶功能區(qū)，這種類胰蛋白酶的存在可能會增強H9N2 AIV的致病性?；旌细腥镜那闆r下，IBV可能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白裂解酶，從而增強了H9N2 AIV的致病性。

［1］陳伯倫，張澤紀，和陳偉斌.禽流感研究：雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，1994，20（10）：3-5.