陳金潔楊云華戴玉嬌

（1.潼南區(qū)玉溪鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 402660；2.潼南區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，重慶 402660）

一種豬氟烷基因的分子檢測方法

陳金潔1楊云華1戴玉嬌2

（1.潼南區(qū)玉溪鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶 402660；2.潼南區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，重慶 402660）

豬應(yīng)激綜合征（PSS，又稱豬惡性高溫綜合征）是由常染色體上單隱性基因控制的一種遺傳疾病，控制豬應(yīng)激綜合征的基因又稱為氟烷基因。氟烷基因廣泛存在于外來豬種和外來豬種與地方品種雜交而育成的品種品系。氟烷基因純合子造成肉質(zhì)下降，產(chǎn)生PSE肉。近年來，各地豬場在努力提高瘦肉率的同時，發(fā)現(xiàn)氟烷基因頻率在豬群中有升高的趨勢，從而給豬場帶來了很大的損失。因此，及早地、準(zhǔn)確地對豬群進(jìn)行氟烷基因的檢測，尤其是從基因型方面進(jìn)行診斷已是勢在必行。正常豬該基因在兩條染色體上都具有Hhal酶切位點，基因型為NN，即有493bp和166bp兩條帶；氟烷敏感型的豬該基因在兩條染色體上都不具有HhaI酶切位點，基因型為nn，即有659bp一條帶；攜帶豬該基因在一條染色體上具有HhaI酶切位點，另一條染色體上不具有HhaI酶切位點，基因型為Nn，即有659bp 、493bp和166bp三條帶。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：Tris飽和酚，分析純，北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；無水乙醇、三氯甲烷，分析純，成都金山；蛋白酶K，MMERCK CO，德國。Taq DNA 聚合酶，dNTP，大連寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶HhaI，大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖、溴酚藍(lán)、二甲苯睛、GODVIEW，DNA Marker，大連寶生物工程有限公司。

試驗動物：隨機(jī)選取重慶某豬場6頭100kg左右的育肥豬，品種為杜洛克父本與本地母本雜交的F1商品代。用耳號鉗夾取少量耳組織，裝入盛70%乙醇的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

離心機(jī)、恒溫水浴鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 技術(shù)路線

耳組織DNA的提取→瓊脂糖電泳檢測→PCR的擴(kuò)增與檢測→酶切消化與酶切產(chǎn)物檢測。

1.3.2 檢測方法

（1） 豬耳組織基因組DNA的提取

常規(guī)酚一氯仿法抽提豬耳組織中的DNA。取約20mg豬耳組織，將組織樣剪碎，加入組織提取液600 μl，混勻。加入蛋白酶 K（20 mg/mL）10μl，至終濃度200 μg/ml，50℃～55 ℃消化過夜。等體積苯酚抽提，12000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，取上清。等體積苯酚：氯仿（1：1）抽提，12000轉(zhuǎn)/min，離心10min，取上清。等體積氯仿抽提，12000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，取上清。2倍體積冰冷的無水乙醇沉淀DNA，12000轉(zhuǎn)/min，離心10 min，棄上清，70%乙醇洗沉淀兩次，真空抽干，用適量TE（pH8.0）溶解DNA。0.7%瓊脂糖電泳后-20℃保存。

（2）酶切產(chǎn)物檢測

待酶切完全后，10000rpm離心lmin，加入2μl溴酚藍(lán)，共17μl，全部加入點樣孔，待電泳。酶切產(chǎn)物電泳在2%瓊脂糖凝膠上點樣，同時點2μLDNAMarker。先在140V電泳約5min，或使指示劑跑出點樣孔，再將電壓控制在50～60V下，電泳3～4h，在凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察結(jié)果并照相，保存電泳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織DNA瓊脂糖檢測結(jié)果

采用 0. 6 %瓊脂糖對提取到的DNA進(jìn)行檢測，以 Goldview 作為指示劑，120V 穩(wěn)壓電泳 45 min，凝膠成像系統(tǒng)成像。若在加樣孔附近有一較亮條帶，其后沒有拖尾條帶或拖尾條帶明顯比其他暗淡，則判斷基因組沒有降解或降解不嚴(yán)重。瓊脂糖電泳檢測（圖1）中顯示，亮帶明顯，不拖尾，說明提取到的DNA效果較好，滿足進(jìn)行后面擴(kuò)增及酶切反應(yīng)的要求。

2.2 PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

利用上述PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測得到如下結(jié)果（圖2）。所有條帶均明顯、清晰可見，說明PCR擴(kuò)增效果良好，再次表明，所提取到的DNA濃度及純度均滿足試驗要求，可以進(jìn)行酶切反應(yīng)。

2.3 酶切產(chǎn)物檢測效果

HhaI酶切產(chǎn)物電泳圖譜檢測得到如下結(jié)果（圖3），顯示493bp和166bp兩條帶的電泳槽，即圖3中編號為2、3、4、6，其基因型NN，為正常型；顯示659bp 、493bp和166bp三條帶，即圖3中編號1、5，基因型Nn，則為攜帶者。6只所抽取的豬只中，2只攜帶者，其余4只為正常型，無氟烷敏感型。

3 討論

氟烷測定法是目前常用的氟烷基因檢測方法，一般臨床應(yīng)用的氟烷濃度為5%，混合氧氣法量為1500～2500ml/5min，供測豬吸入氟烷-氧混合氣持續(xù)時間為3～5min。2～3月齡幼豬吸入混合氣1min后如果立即失去知覺，3～4min后表現(xiàn)肌肉痙攣，四肢僵直，則稱為氟烷陽性豬，4min后未出現(xiàn)任何癥狀，四肢松軟的稱為氟烷陰性豬。此法簡單、易操作，但準(zhǔn)確性較低，且只能檢測出Hhalnn純合子，無法區(qū)分HhalNN純合子和HhalNn雜合子，也就是說無法凈化豬群中的氟烷有害基因。本方法比較于氟烷檢測，可以檢測出3種基因型而更準(zhǔn)確，避免了對被檢測豬只的干擾。血液遺傳標(biāo)記選擇法是用PHIB連鎖基因來診斷氟烷基因型，相比于氟烷測定法準(zhǔn)確性較高，但是用其他連鎖基因檢測的準(zhǔn)確性很難預(yù)測，導(dǎo)致此法的應(yīng)用受到很大限制。而DNA探針技術(shù)由于程序復(fù)雜，操作難度較大，亦不便推廣。PCR-SSCR法和PCR-RFLP法雖然準(zhǔn)確性高，但由于需要擴(kuò)增特定的DNA片段，也給檢測帶來不便。綜上所述，本文介紹的方法耗時較短，操作相對簡便，并且可以獲得良好的檢測效果，不失為一種豬氟烷基因檢測的優(yōu)良方法。當(dāng)然，隨著分子生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和先進(jìn)檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用，豬氟烷基因的檢測方法也將朝著更簡便、快速、準(zhǔn)確的方向發(fā)展，相信在不久的將來，一定會有更好的氟烷基因檢測方法面世。

4 結(jié)論

使用本方法進(jìn)行氟烷基因檢測，取得了預(yù)期的效果，為豬場在選種提純提供了重要的依據(jù)，對生豬生產(chǎn)具有較大意義，便于及早地進(jìn)行氟烷基因的檢測，即時地淘汰隱性純合子個體，有效地避免父母代豬群中雜合子公豬與雜合子母豬的交配，并能嚴(yán)格控制后備豬群中氟烷基因的存在，引種時能夠做好應(yīng)激綜合征的檢測等。另外，由于氟烷基因具有多效性，一方面作為應(yīng)激反應(yīng)的主效基因，導(dǎo)致豬的死亡率升高，同時減少窩產(chǎn)仔數(shù)，增加劣質(zhì)肉率；另一方面，對豬的產(chǎn)肉力呈加性效應(yīng)，可提高瘦肉率。目前，氟烷基因的檢測技術(shù)已趨完善，正向著更簡便快速的方向發(fā)展。在生產(chǎn)實踐中，掌握了快速準(zhǔn)確的氟烷基因檢測技術(shù)，可以培育抗應(yīng)激專門化品系為母本，以高瘦肉率的應(yīng)激品系為父本，建立雜交繁育體系，其F1商品代皆為Nn型個體，這樣既可以防止劣質(zhì)肉、降低應(yīng)激死亡率，又可以利用Nn個體的雜種優(yōu)勢，提高瘦肉率，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的商品瘦肉型豬。另外，如果繼續(xù)試驗，對已知基因型的豬群進(jìn)行雜交，再次檢測子代基因型，可以從遺傳角度驗證這種檢測方法的效果。