李　邐，　王　純，　盧宏達(dá)

(武漢市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430014)

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馬錢子堿通過抑制IL-6/STAT3信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡*

李邐，王純，盧宏達(dá)△

(武漢市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430014)

[摘要]目的： 探討馬錢子堿(brucine)在體外對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長和凋亡的影響及可能的分子機制。方法: 實驗以人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞為研究對象，分為空白對照組、 brucine(1 μmol/L)處理組、IL-6(100 μg/L)處理組和brucine(1 μmol/L)與IL-6(100 μg/L)聯(lián)用組，用CCK-8法檢測細(xì)胞活力抑制率；流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光檢測相關(guān)蛋白表達(dá)定位和強度。結(jié)果: Brucine處理組和brucine與IL-6聯(lián)用組都能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的活力，brucine濃度相同時，聯(lián)用組抑制率小于brucine處理組(P<0.05)。與空白對照組相比，單用brucine處理組凋亡細(xì)胞明顯增多(P<0.05)。與單用brucine相比，brucine與IL-6聯(lián)用組凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。與對照組相比， brucine能降低p-STAT3蛋白水平。與空白對照組相比，單用brucine組p-STAT3的蛋白減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bax和執(zhí)行凋亡的cleaved PARP明顯增多；與空白對照組相比，單用IL-6處理組的p-STAT3明顯增多(P<0.05)；而與單用brucine相比，brucine與IL-6聯(lián)合應(yīng)用組的p-STAT3蛋白增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增多，促凋亡蛋白Bax和執(zhí)行凋亡的cleaved PARP均相對減少(P<0.05)。結(jié)論: 體外細(xì)胞實驗中brucine可能通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3通路，抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中STAT3的磷酸化激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

[關(guān)鍵詞]馬錢子堿； 結(jié)腸癌； IL-6/STAT3通路； 細(xì)胞凋亡

結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢[1]。目前化學(xué)治療仍然是結(jié)直腸癌治療的關(guān)鍵方法之一。近年來，隨著新的化療藥物、靶向藥物的出現(xiàn)及化療方案的制定，結(jié)直腸癌治療取得了巨大進(jìn)步，但仍有較大部分患者療效欠佳，甚至出現(xiàn)治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。因此，尋找新的治療方法和藥物，以減少腫瘤復(fù)發(fā)，改善患者生存質(zhì)量，顯得尤為重要。馬錢子，另名番木鱉，為馬錢屬植物馬錢(Strychnosnux-vomicaL．)的成熟種子,其主要有效成分為生物堿類，包括馬錢子堿(brucine)、士的寧(strychnine)、番木鱉次堿(vomicine)等。藥理學(xué)研究表明，馬錢子生物堿有多重藥理作用，主要包括鎮(zhèn)痛抗炎、抗菌、抗血栓、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[2]。近年來關(guān)于馬錢子堿的抗腫瘤活性作用引起關(guān)注[3]。馬錢子堿是白色結(jié)晶性粉末，分子式為C23H26N2O4，分子量為394.45。馬錢子堿對肝癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移和大腸癌都有明顯的抑制作用，但其具體作用機制有待深入研究[4]。本實驗用馬錢子堿作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，探討馬錢子堿對SW480細(xì)胞活力和凋亡的影響，探討其抗人結(jié)腸癌的作用靶點，為馬錢子堿用于臨床治療結(jié)腸癌提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1材料和儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購自ATCC，細(xì)胞復(fù)蘇后置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；馬錢子堿購自成都曼斯特生物科技有限公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自Dojindo；Annexin V/PI雙染試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)公司； IL-6購自Peprotech；熒光 II 抗購自Cell Signaling Technology；DAPI購自Roche；cleaved PARP、Bax、Bcl-2、p-STAT3、STAT3和GAPDH抗體均購自Cell Signaling Technology；化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自Pierce；倒置顯微鏡(Olympus)；熒光顯微鏡(Zeiss)；流式細(xì)胞儀(BD FACScantoTM)。

2方法

2.1CCK-8法檢測brucine對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞活力的影響實驗設(shè)空白對照組、brucine(1 μmol/L)處理組、IL-6(100 μg/L)處理組和brucine(1 μmol/L)聯(lián)用IL-6(100 μg/L)組。取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，以每孔100 μL含5 000個細(xì)胞的懸液接種于96孔板。將其置于37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后去上清，按分組加入馬錢子堿和(或)細(xì)胞因子IL-6處理，每組5個復(fù)孔。各組用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度(A)值(測定波長450 nm)，計算各組細(xì)胞活力抑制率。細(xì)胞活力抑制率(%)= (A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。同時倒置顯微鏡觀察單用馬錢子堿和馬錢子堿聯(lián)用細(xì)胞因子IL-6組光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2Annexin V/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡實驗設(shè)空白對照組、brucine(1 μmol/L)處理組、IL-6(100 μg/L)處理組和brucine(1 μmol/L)聯(lián)用IL-6(100 μg/L)組。 取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板過夜，棄上清，按分組加入1 μmol/L的馬錢子堿和(或)100 μg/L的細(xì)胞因子IL-6。培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌細(xì)胞3次，按試劑盒說明書分別加入Annexin V-FITC 和PI，4 ℃避光反應(yīng)30 min，再加入300 μL binding buffer，均勻吹打后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

2.3Western blot實驗將處理后的細(xì)胞，用PBS沖洗，蛋白裂解液冰上充分裂解后，置于4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min，取上清液，測定蛋白含量，加入上樣緩沖液沸水中煮5 min，進(jìn)行SDS-PAGE。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜；膜用5%脫脂牛奶封閉2 h，然后加 I 抗在4 ℃孵育過夜。次日PBS洗3遍，每次5 min，再加II抗在搖床室溫孵育1 h，洗膜后經(jīng)ECL發(fā)光試劑顯影，最后于暗室X線膠片感光。

2.4細(xì)胞免疫熒光染色取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×108/L濃度接種于放有消毒滅菌玻片的6孔板中，設(shè)置空白對照組、brucine(1 μmol/L)處理組和brucine(4 μmol/L)處理組。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗2次，每次5 min，用4%多聚甲醛1 mL室溫固定30 min。用PBS洗2次，每次5 min，加入0.1%～0.2% Triton溶液1 mL，室溫反應(yīng)20 min。用PBS洗2次后加入5% BSA封閉1 h。加入相應(yīng)的 I 抗，4 ℃過夜。棄 I 抗后避光，加入1∶1 000的熒光 II 抗，室溫孵育1 h。加入DAPI溶液，室溫避光反應(yīng)15 min，用PBS洗2次后在載玻片上滴上甘油(甘油∶PBS=1∶1)，將蓋玻片的細(xì)胞面，貼于載玻片上，四周用指甲油封片。

3統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，運用方差分析進(jìn)行組間差異比較，各組數(shù)據(jù)方差齊時，組間多樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1單獨應(yīng)用brucine和brucine聯(lián)用IL-6對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響

CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L的 brucine抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力(P<0.05)。Brucine和IL-6聯(lián)合應(yīng)用時也能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力，但brucine濃度相同時，brucine和IL-6聯(lián)用組的細(xì)胞活力更好，抑制率小于單用brucine組(P<0.05)。 Olympus 倒置顯微鏡也觀察到類似結(jié)果，單用brucine(1 μmol/L)時，光鏡下變圓、折光率變低的細(xì)胞較多，brucine(1 μmol/L)和IL-6(100 μg/L)聯(lián)用給藥組光鏡下變圓、折光率變低的細(xì)胞相對較少，見圖1。

Figure 1.The viability inhibitory rate of the SW480 cells treated with brucine and brucine combined with IL-6. The cell morphology was observed under microscope (×400). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsbrucine.

圖1單用brucine和brucine聯(lián)用IL-6對結(jié)腸癌細(xì)胞活力的抑制率

2單獨應(yīng)用brucine和brucine聯(lián)用IL-6對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，單用brucine(1 μmol/L)組凋亡細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，而單用IL-6(100 μg/L)時無明顯細(xì)胞凋亡。與單用brucine(1 μmol/L)相比，brucine(1 μmol/L)和IL-6 (100 μg/L)聯(lián)用組凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，見圖2。

3Brucine降低SW480細(xì)胞中p-STAT3蛋白水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μmol/L和4 μmol/L的brucine均能抑制p-STAT3的蛋白水平，濃度越高，抑制效率越明顯(P<0.05)，而總STAT3蛋白表達(dá)變化不明顯。細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，對照組中p-STAT3蛋白主要定位在細(xì)胞核，為綠色熒光，4 μmol/L的brucine處理組中綠色熒光的p-STAT3蛋白明顯減少，見圖3。

4Brucine促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡與降低p-STAT3蛋白水平密切相關(guān)，IL-6介導(dǎo)的p-STAT3升高可以降低brucine對SW480細(xì)胞凋亡的作用

如圖4所示，Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，單用brucine(1 μmol/L)組p-STAT3和抗凋亡蛋白Bcl-2減少，促凋亡蛋白Bax和執(zhí)行凋亡的活化的cleaved PARP明顯增多；與空白對照組相比，單用IL-6(100 μg/L)處理組的p-STAT3蛋白明顯增多(P<0.05)；而與單用brucine(1 μmol/L)組相比，brucine(1 μmol/L)和IL-6(100 μg/L)聯(lián)用組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax和執(zhí)行凋亡的活化的cleaved PARP均相對減少(P<0.05)。

Figure 2.The apoptosis of SW480 cells induced by brucine and brucine combined with IL-6. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsbrucine.

圖2單用brucine和brucine聯(lián)用IL-6對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3.The effects of brucine induction for 24 h on the protein levels of p-STAT3 and STAT3 were detected by Western blot (A) and immunofluorescence staining (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vs1 μmol/L brucine.

圖3Brucine抑制SW480細(xì)胞的p-STAT3蛋白水平

討論

近年來發(fā)現(xiàn)，brucine對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用[5]。在肝癌細(xì)胞HepG2的體外研究中，brucine主要通過調(diào)節(jié)鈣離子濃度以及線粒體的去極化抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，也有研究表明brucine能通過條件缺氧誘導(dǎo)因子的相關(guān)通路抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]。在非小細(xì)胞肺癌體外細(xì)胞實驗中，brucine可以通過抑制NF-κB表達(dá)和隨后的COX-2基因表達(dá)介導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[8]。在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的裸鼠體內(nèi)模型中，brucine可能通過下調(diào)VEGF表達(dá)抑制腫瘤血管生成，抑制乳腺癌的生長及骨轉(zhuǎn)移[9]。在多發(fā)性骨髓瘤體外細(xì)胞實驗中，brucine增強U266細(xì)胞中JNK信號通路c-Jun和磷酸化水平誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。在結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞中，brucine通過下調(diào)KDR激酶活性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，抑制其血管生成，同時brucine能通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達(dá)介導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[11-12]。同樣的，在人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1中，brucine能抑制腫瘤細(xì)胞生長，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。根據(jù)以上研究結(jié)果提示，brucine主要通過抑制腫瘤血管生成，介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

近年研究表明，STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯聚的焦點，STAT3靶點的活化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用尤為重要[14]。STAT3在多種腫瘤細(xì)胞和組織中都存在過度激活，如乳腺癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、腦瘤、非小細(xì)胞肺癌和各種白血病等[15]。STAT3激活后調(diào)控相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖(MYC和cyclin D1/D2)、抗細(xì)胞凋亡(Bcl-xL、Mcl1、survivin和P53)、促進(jìn)血管生成(VEGF、HIF1和P53)、遷移和侵襲(MMP3和MMP9)，從而表現(xiàn)出致癌作用[16]。

Figure 4.The protein levels of the apoptosis-related molecules in the SW480 cells induced by brucine and brucine combined with IL-6invitrodetected by Western blot after 24 h treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsbrucine.

圖4Brucine誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞凋亡與下調(diào)p-STAT3密切相關(guān)，IL-6介導(dǎo)的p-STAT3的升高可以降低brucine誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞凋亡

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中，brucine可能通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞中STAT3磷酸化水平，來抑制SW480細(xì)胞活力，同時上調(diào)細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，使剪切的DNA修復(fù)酶PARP增多，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Brucine與IL-6聯(lián)用時，可能由于IL-6能激活并維持腫瘤細(xì)胞中STAT3磷酸化水平，導(dǎo)致brucine抑制SW480細(xì)胞凋亡的能力減弱。綜上所述，我們在體外細(xì)胞實驗中證明了brucine可能通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3通路，抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中STAT3磷酸化激活，而發(fā)揮抗腫瘤作用。同時，我們需要進(jìn)一步使用IL-6抑制劑證明brucine通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3通路發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用，以及在動物體內(nèi)驗證brucine通過抑制STAT3磷酸化激活進(jìn)而對抗結(jié)腸癌的作用機制，為臨床上運用brucine治療結(jié)腸癌提供參考。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Brucine induces apoptosis in colon cancer SW480 cells via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway

LI Li, WANG Chun, LU Hong-da

(DepartmentofOncology,TheCentralHospitalofWuhan,Wuhan430014,China.E-mail:phlonda@163.com)

[KEY WORDS]Brucine; Colon cancer; IL-6/STAT3 pathway; Cell apoptosis

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of brucine on the viability and apoptosis of colon cancer SW480 cells.METHODS: The SW480 cells were divided into control group, 1 μmol/L brucine treatment group, 100 μg/L IL-6 treatment group and IL-6+brucine treatment group. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The apoptotic rate was measured by flow cytometry using fluorescein-labeled Annexin V/PI. The changes of apoptosis-related proteins were determined by Western blot. The protein level of p-STAT3 was also detected by immunofluorescence staining. RESULTS: Brucine inhibited SW480 cell growth, and the viability inhibition rate of the SW480 cells treated with brucine alone was more efficient than using brucine combined with IL-6 (P<0.05). The apoptotic SW480 cells increased significantly after 1 μmol/L brucine treatment as compared with brucine treatment alone (P<0.05). The apoptotic SW480 cells were significantly reduced in brucine and IL-6 combination treatment group (P<0.05). Brucine inhibited the protein level of p-STAT3 significantly. The protein level of p-STAT3 was significantly increased in 100 μg/L IL-6 treatment group. Compared with 1 μmol/L brucine treatment alone, the expression of Bcl-2 was increased and the protein levels of p-STAT3, Bax and cleaved PARP were reduced in brucine and IL-6 combination treatment group (P<0.05).CONCLUSION: Brucine may inhibit the activation of STAT3 phosphorylation in IL-6/STAT3 pathway to exert an antitumor effect on SW480 cellsinvitro.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 0998- 06

[收稿日期]2015- 12- 07[修回日期] 2016- 03- 01

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81372931);湖北省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2012FFB05904);武漢市科技攻關(guān)計劃(No. 2013060602010253)

通訊作者△Tel: 027-65699909; E-mail: phlonda@163.com

[中圖分類號]R730.23; R735.3+7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.006