董雅潔，　高維娟，　錢(qián)　濤，　盧鍇鋒，　朱炎杰，　謝亞芹

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；3河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

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Bcl-2抑制劑對(duì)黃芪注射液降低缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3表達(dá)的影響*

董雅潔1，高維娟2△，錢(qián)濤3，盧鍇鋒1，朱炎杰1，謝亞芹1

(1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；3河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的： 觀察Bcl-2抑制劑對(duì)黃芪注射液降低缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3表達(dá)的影響。方法: 取體外原代培養(yǎng)8 d的海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組)、黃芪注射液組、黃芪注射液溶劑(無(wú)菌去離子水)對(duì)照組、Bcl-2抑制劑組和Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組。除正常對(duì)照組外均進(jìn)行缺氧缺糖0.5 h再?gòu)?fù)氧復(fù)糖，各組均于復(fù)氧復(fù)糖后24 h進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)：采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法觀察細(xì)胞形態(tài)和caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞率，Western blotting法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果: 與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞caspase-3陽(yáng)性率、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與模型組相比，黃芪注射液組Bcl-2表達(dá)明顯增加，細(xì)胞caspase-3陽(yáng)性率、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；而黃芪注射液溶劑對(duì)照組、Bcl-2抑制劑組及Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組則無(wú)明顯差異;黃芪注射液溶劑對(duì)照組Bcl-2表達(dá)較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化，而B(niǎo)cl-2抑制劑組及Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組顯著下降(P<0.05)。結(jié)論: Bcl-2抑制劑可對(duì)抗黃芪注射液降低缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3表達(dá)的作用，黃芪注射液通過(guò)Bcl-2發(fā)揮對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用。

[關(guān)鍵詞]海馬神經(jīng)元； 黃芪注射液； Bcl-2抑制劑； 缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖； 細(xì)胞凋亡； Caspase-3

缺血再灌注損傷是制約腦缺血再灌注療效的重要病理生理機(jī)制[1]，而細(xì)胞凋亡在其中發(fā)揮著重要的作用，其中Bcl-2是與細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的凋亡調(diào)控基因。現(xiàn)代中藥制劑黃芪注射液以黃芪提取物為主要成分，是目前臨床上針對(duì)性治療缺血性腦血管病的常用藥物之一。本研究室前期的實(shí)驗(yàn)研究證明，黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡有抑制作用[2]，可抑制凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)[3]，且初步推測(cè)其抗凋亡作用與上調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)[4]。為了進(jìn)一步證實(shí)黃芪注射液是否通過(guò)提高Bcl-2的活性發(fā)揮抗凋亡作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用黃芪注射液作用于Bcl-2抑制劑干預(yù)下的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元，觀察Bcl-2抑制劑對(duì)活化的caspase-3(cleaved caspase-3)表達(dá)的影響，進(jìn)而探討黃芪注射液對(duì)缺血再灌注腦組織海馬神經(jīng)元保護(hù)作用的分子機(jī)制。

材料和方法

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)新生24 h雌雄SD大鼠，由天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(津)2009-001。

1.2主要試劑Bcl-2抑制劑TW-37購(gòu)自Selleck；兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz；兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購(gòu)于Chemicon；兔抗大鼠cleaved caspase-3單克隆抗體購(gòu)于CST；SP免疫組化染色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海申能博彩生物科技有限公司；caspase-3引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)；RT-PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa；多聚賴(lài)氨酸、DNaseⅠ和阿糖胞苷均購(gòu)自Sigma；特級(jí)胎牛血清、馬血清均購(gòu)自HyClone；谷氨酰胺和胰蛋白酶均購(gòu)于武漢華美科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和B27均由Gibco生產(chǎn)；黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z51021775；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器HERAcell 150型CO2培養(yǎng)箱由Heraeus生產(chǎn)；Leica DM IL 090-135.001型倒置顯微鏡由Leica生產(chǎn)；TDL-40B離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器制造廠；MK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀由芬蘭雷勃公司生產(chǎn)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-6B)由北京六一儀器廠生產(chǎn)；RT-PCR儀(PTC-100)由MJ Research生產(chǎn)。

2方法

2.1海馬神經(jīng)元的分離與培養(yǎng)取新生24 h SD大鼠，浸于冰浴的75%乙醇1 min消毒，沿顱骨中縫“工”字形剪開(kāi)其頭皮及顱骨，用顯微眼科鑷鈍性分離，夾取海馬組織，放入冰盒上盛有D-Hanks液的玻璃培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下，去除含有血管的軟腦膜，靜置后，吸去上層D-Hanks液，并加入與組織等體積的0.125%的胰蛋白酶，同時(shí)用眼科剪將海馬組織剪切至1 mm×1 mm×1 mm小塊，充分消化15 min后，用胰酶量10%的馬血清終止消化過(guò)程。將組織塊混合液移入玻璃離心管中，充分吹打離散，以1 000 r/min離心5 min，離心3次，去上清后，根據(jù)海馬組織量加入適量有血清種植培養(yǎng)液，充分吹打，制成細(xì)胞懸液，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾。在倒置顯微鏡(×100)下經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)后，接種在經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后將培養(yǎng)基全部換為無(wú)血清培養(yǎng)液；第4天換去一半無(wú)血清培養(yǎng)液，并添加全液量1%的阿糖胞苷液，以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)；于第5天將培養(yǎng)基全部替換成新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液。以后每隔1 d把一半培養(yǎng)液換成新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)8 d后，即可用于海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模型的建立及指標(biāo)的檢測(cè)。

2.2海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組取原代培養(yǎng)8 d的大鼠海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組(缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組)、黃芪注射液組、黃芪注射液溶劑(無(wú)菌去離子水)對(duì)照組、Bcl-2抑制劑組和Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組。正常對(duì)照組不做任何特殊處理，正常培養(yǎng)。其余各組均參照Bossenmeyer等[5]的方法制作模型：取無(wú)糖Earle’s液替代無(wú)血清培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃溫箱里的缺氧裝置中，快速通入高純N25 min后，再調(diào)節(jié)分壓至1.5 kPa，繼續(xù)緩慢、勻速、連續(xù)通入。缺氧缺糖30 min后，換正常無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。黃芪注射液組于缺氧缺糖的同時(shí)加入終濃度為0.5 g/L的黃芪注射液，直至細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束；黃芪注射液溶劑對(duì)照組處理方法與黃芪注射液組相同，只是將黃芪注射液換為等量的pH 7.4的無(wú)菌去離子水；Bcl-2抑制劑組于缺氧缺糖前5 min加入終濃度為400 nmol/L Bcl-2抑制劑TW-37直至細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束。Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組處理方法與黃芪注射液組相同，但也要于缺氧缺糖前5 min加入Bcl-2抑制劑，直至細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束。各組均于復(fù)氧復(fù)糖后24 h分別觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、細(xì)胞caspase-3陽(yáng)性率、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及caspase-3 mRNA表達(dá)。

2.3細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測(cè)海馬神經(jīng)元caspase-3蛋白的表達(dá)取經(jīng)冷丙酮固定的海馬神經(jīng)元，采用免疫組化SP法檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá)，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體按1∶100稀釋?zhuān)琍BS替代 I 抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿及突起呈棕黃色顆粒狀染色。對(duì)免疫組化陽(yáng)性結(jié)果采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2.4Western blotting 法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá) 收集神經(jīng)細(xì)胞，提取胞漿蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量測(cè)定。取30 μg樣品蛋白，按4∶1的比例將蛋白樣品與loading buffer(5×)混勻，95 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，以12% SDS-PAGE分離蛋白，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到已用甲醇激活的PVDF膜上，浸入5% milk-TBST封閉液中封閉2 h，加入兔抗大鼠 Bcl-2多克隆抗體(1∶1 500稀釋)和兔抗大鼠cleaved caspase-3單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育60 min。洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法顯影、定影。膠片掃描后，用Quantity One 軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行定量分析，分別計(jì)算Bcl-2、cleaved caspase-3條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5RT-PCR法檢測(cè)海馬神經(jīng)元caspase-3的mRNA表達(dá)收集神經(jīng)細(xì)胞，采用TRIzol一步法抽提總RNA，按TaKaRa RNA PCR kit (AMV)說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Caspase-3上游引物序列5′-ACTGGACTGTGGCATTGAG-3′，下游引物序列5′-GAAACAATACATGGAATCTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300 bp。內(nèi)參照β-actin上游引物序列5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游引物序列5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為480 bp。擴(kuò)增條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s,53 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s，循環(huán)30次;最后72 ℃ 3 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，紫外透射儀觀察采集圖像。用Quantity One凝膠分析軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算caspase-3條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為二者mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異顯著性用方差分析法檢驗(yàn)，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié)果

1Bcl-2抑制劑對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬神經(jīng)元胞核固縮，胞漿大量黃染，胞核內(nèi)有少許黃色顆粒，細(xì)胞caspase-3陽(yáng)性率比正常對(duì)照組表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與模型組相比，黃芪注射液組大鼠海馬神經(jīng)元僅有輕微的核皺縮，神經(jīng)元caspase-3陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05)，而黃芪注射液溶劑對(duì)照組、Bcl-2抑制劑組及Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組則無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖1。

2Bcl-2抑制劑對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，模型組海馬神經(jīng)元Bcl-2蛋白的平均灰度值明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，黃芪注射液組Bcl-2蛋白的平均灰度值明顯增高(P<0.05)，Bcl-2抑制劑組及Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組則明顯降低(P<0.05)，而黃芪注射液溶劑對(duì)照組無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The effects of Bcl-2 inhibitor on the protein expression of cleaved caspase-3 in the rat hippocampal neurons after oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD/R) detected by immunohistochemistry (×400). Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;*P<0.05vsOGD/R.

圖1免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)Bcl-2抑制劑對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Figure 2The effects of Bcl-2 inhibitor on the protein expression of Bcl-2 in the rat hippocampal neurons after OGD/R detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;#P<0.05vsOGD/R.

圖2Western blotting 法檢測(cè)Bcl-2抑制劑對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3Bcl-2抑制劑對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，模型組海馬神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白的平均灰度值明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，黃芪注射液組海馬神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白的平均灰度值明顯降低(P<0.05)，而黃芪注射液溶劑對(duì)照組、Bcl-2抑制劑組及Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖3。

4Bcl-2抑制劑對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比，模型組海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA的平均吸光度值明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，黃芪注射液組caspase-3 mRNA的平均吸光度值明顯降低(P<0.05)，黃芪注射液溶劑對(duì)照、Bcl-2抑制劑組及Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組組無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The effects of Bcl-2 inhibitor on the protein expression of cleaved caspase-3 in the rat hippocampal neurons after OGD/R detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;*P<0.05vsOGD/R．

圖3Western blotting 法檢測(cè)Bcl-2抑制劑對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.The effects of Bcl-2 inhibitor on the mRNA expression of caspase-3 in the rat hippocampal neurons after OGD/R detected by RT-PCR. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal control;*P<0.05vsOGD/R.

圖4RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2抑制劑對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

討論

神經(jīng)元凋亡是腦缺血再灌注后細(xì)胞死亡的重要形式，線粒體通路在細(xì)胞存亡機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。本課題組前期研究證實(shí)，缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖可通過(guò)激活JNK3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡[6]。而在眾多的凋亡調(diào)控基因及其蛋白中，位于JNK信號(hào)通路的下游的Bcl-2和caspase-3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[7-8]。

Bcl-2是Bcl-2家族中第一個(gè)被確認(rèn)的能對(duì)抗細(xì)胞凋亡的蛋白，分布于線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，位于線粒體上游，通過(guò)操控線粒體膜間隙蛋白的釋放對(duì)細(xì)胞凋亡加以調(diào)控[9]。Caspase-3是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的執(zhí)行者，是哺乳動(dòng)物凋亡機(jī)制中的關(guān)鍵因素，分布于胞質(zhì)中，初始無(wú)活性，當(dāng)收到凋亡信號(hào)刺激被激活后，轉(zhuǎn)變?yōu)閏leaved caspase-3，便可大范圍地水解細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì)，從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，因此被認(rèn)為是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶[10-11]。過(guò)表達(dá)的Bcl-2蛋白可與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的轉(zhuǎn)位及二聚體化，關(guān)閉PT孔道，通過(guò)阻斷細(xì)胞色素C的釋放，抑制下游caspase-3的激活，而有效地抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12-13]。

作為補(bǔ)益類(lèi)中藥，黃芪具有補(bǔ)氣固表、利尿退腫、解毒生肌的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪能顯著地提高缺血性腦組織中的超氧化物歧化酶含量，清除氧自由基，增加微循環(huán)灌注，以保護(hù)腦缺血/再灌注損傷的作用[14]。黃芪注射液是臨床上治療缺血性腦損傷的常用藥物，可有效地抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]，其對(duì)體外培養(yǎng)的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠原代海馬神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用，可有效抑制大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，顯著提高細(xì)胞的活性[2, 6]。

本研究結(jié)果顯示，模型組海馬神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2及cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA的表達(dá)均顯著高于正常組，而與模型組比，黃芪注射液組Bcl-2的表達(dá)顯著增加，而cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA的表達(dá)則顯著降低。分析原因可能是海馬神經(jīng)元在缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖的條件下細(xì)胞凋亡信號(hào)開(kāi)始啟動(dòng)，Bcl-2的表達(dá)隨之升高，抑制細(xì)胞凋亡，但隨著B(niǎo)ax表達(dá)的進(jìn)一步增多，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值下降，Bax/Bax同源二聚體增多，PT孔道開(kāi)放，促使細(xì)胞色素C與Apaf-1結(jié)合增多，進(jìn)而活化caspase-3，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]，而黃芪注射液可顯著提高Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用。且本實(shí)驗(yàn)觀察到Bcl-2抑制劑組及Bcl-2抑制劑+黃芪注射液組Bcl-2的表達(dá)較模型組明顯降低，但cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA的表達(dá)卻與之無(wú)顯著差異，則提示Bcl-2抑制劑可對(duì)抗黃芪注射液降低缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元cleaved caspase-3的表達(dá)，由此推測(cè)Bcl-2可能是黃芪注射液發(fā)揮對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡抑制作用的靶點(diǎn)之一，這為缺血性腦血管病的靶向治療提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Influence of Bcl-2 inhibitor on Astragalus injection-reduced expression of caspase-3 in rat hippocampal neurons with oxygen-glucose deprivation and reoxygenation

DONG Ya-jie1, GAO Wei-juan2, QIAN Tao3, LU Kai-feng1, ZHU Yan-jie1, XIE Ya-qin1

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiUniversityofChineseMedicine,Shijiazhuang050200,China;3HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China.E-mail:gwj6088@163.com)

[KEY WORDS]Hippocampal neurons;Astragalusinjection; Bcl-2 inhibitor; Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation; Apoptosis; Caspase-3

[ABSTRACT]AIM: To observe the influence of Bcl-2 inhibitor on the expression of caspase-3 reduced byAstra-galusinjection in rat hippocampal neurons with oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD/R). METHODS: The primary rat hippocampal neurons culturedinvitrofor 8 d were chosen and randomly divided into 6 groups: normal control group, model group (OGD/R group),Astragalusinjection group,Astragalusinjection solvent (sterile deionized water)group, Bcl-2 inhibitor group and Bcl-2 inhibitor withAstragalusinjection group. The cells in all groups were tested 24 h after they were treated with reoxygenation after deprived of oxygen and glucose for 30 min except normal control group. The cell type and rate of positive cells were observed by immunohistochemistry. The protein levels of Bcl-2 and cleaved caspase-3 in the hippocampal neurons were measured by Western blotting. The mRNA expression of caspase-3 was detected by RT-PCR. RESULTS: Compared with normal control group, the caspase-3 positive rate of the cells, the protein levels of Bcl-2 and cleaved caspase-3, and the mRNA expression of caspase-3 in model group enhanced significantly (P<0.05). Compared with model group, the expression of Bcl-2 inAstragalusinjection group obviously enhanced, while the caspase-3 positive rate of the cells, the protein level of cleaved caspase-3 and the mRNA expression of caspase-3 in theAstragalusinjection group decreased significantly (P<0.05). No significant difference in injection solvent group, Bcl-2 inhibitor group and Bcl-2 inhibitor withAstragalusinjection group was observed (P>0.05). The expression of Bcl-2 was decreased sharply in Bcl-2 inhibitor group and Bcl-2 inhibitor withAstragalusinjection group. CONCLUSION: Bcl-2 inhibitor antagonizes the inhibitory effect ofAstragalusinjection on caspase-3 expression in rat hippocamal neurons with OGD/R, which may be one of the possible target for the inhibitory action ofAstragalusinjection on the apoptosis of rat hippocampal neurons induced by OGD/R.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1051- 06

[收稿日期]2015- 07- 02[修回日期] 2016- 04- 21

*[基金項(xiàng)目]河北省科技支撐計(jì)劃(No. 13272504D)；河北省普通高等學(xué)校高層次人才科學(xué)研究計(jì)劃(No. GCC2014031)；河北省教育廳青年基金項(xiàng)目(No. Q2012002)；河北省高校重點(diǎn)學(xué)科(病理學(xué)與病理生理學(xué))資助項(xiàng)目(冀教高[2013]4號(hào))

通訊作者△Tel: 0311-89926007; E-mail: gwj6088@163.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2016.06.015