李　衛(wèi)，　鄭　然，　蔡　康，　鄭　寬，　王兆瑞

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510630；2香港大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó) 香港)

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創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠外周血CD8的變化*

李衛(wèi)1△，鄭然2，蔡康1，鄭寬1，王兆瑞1

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510630；2香港大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó) 香港)

[摘要]目的： 探討外周血CD8在創(chuàng)傷性腦損傷后的變化特點(diǎn)。方法: 改良Feeney′s自由落體打擊法制備創(chuàng)傷性腦損傷模型；ELISA檢測(cè)大鼠血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和CD8的含量，雙變量分析兩者的相關(guān)性；Western blot法檢測(cè)大鼠血液淋巴細(xì)胞FasL蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 顱腦外傷后大鼠血清CD8升高滯后于NSE。大鼠傷后1 d 血清NSE水平即顯著升高，傷后3 d達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；大鼠血清CD8在傷后3 d開始升高，峰值出現(xiàn)在傷后7 d，隨后逐漸下降。統(tǒng)計(jì)分析顯示傷后1 d、3 d、7 d的血清的NSE與傷后3 d、7 d、14 d的血清CD8含量變化呈現(xiàn)正相關(guān)。但傷后不同時(shí)間大鼠血液淋巴細(xì)胞FasL蛋白表達(dá)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論: 創(chuàng)傷性腦損傷后釋放入血的NSE刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，引起外周血CD8增多，推測(cè)其可能與創(chuàng)傷性腦損傷后繼發(fā)性損傷的免疫應(yīng)答有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]創(chuàng)傷性腦損傷； 神經(jīng)元特異性烯醇化酶； CD8； FasL

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科常見(jiàn)疾病，TBI所致的嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙和巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尤其是重癥顱腦損傷患者存在療效差、致殘率和死亡率高的問(wèn)題，已成為全球性難題。TBI是由于各種機(jī)械外力作用所致的顱腦損傷，根據(jù)其病理過(guò)程可以分為原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷兩個(gè)階段。原發(fā)性腦損傷是指外力引起的腦組織直接損傷；繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷基礎(chǔ)上產(chǎn)生的二次腦損傷，傷后立即開始，可持續(xù)數(shù)小時(shí)至數(shù)周。臨床研究顯示在致死性TBI病例中70%～90%病人出現(xiàn)繼發(fā)性腦損傷。由于無(wú)法干預(yù)原發(fā)性損傷，臨床治療TBI的重點(diǎn)多放在繼發(fā)性腦損傷的防治上。因此，闡明繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生機(jī)制對(duì)提高TBI的療效和預(yù)后具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)TBI后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生與損傷局部腦組織的炎癥反應(yīng)、血腦屏障的破壞、興奮性氨基酸釋放、Ca2+超載及氧化應(yīng)激等一系列病理變化有關(guān)[1-3]。這些機(jī)制的闡明為TBI治療提供了新的理念和方法，如鈣通道阻滯劑和自由基清除劑的應(yīng)用可改善TBI患者的療效。但迄今為止，TBI患者的治療依然存在預(yù)后不佳的情況。近年來(lái)免疫應(yīng)答在腦損傷中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。本課題組以前的研究發(fā)現(xiàn)，在TBI大鼠腦組織損傷灶及其周邊有大量CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并且相應(yīng)區(qū)域神經(jīng)元凋亡數(shù)量也明顯增多，推測(cè)自身免疫反應(yīng)可能參與繼發(fā)性腦組織損傷的過(guò)程[4]。本研究擬觀察TBI后大鼠血液循環(huán)中CD8的變化特點(diǎn)，結(jié)合既往的研究結(jié)果從整體水平探討TBI后機(jī)體的免疫反應(yīng)狀況，以期為TBI治療提供新的策略。

材料和方法

1材料

1.1儀器自制改良Feeney′s自由落體打擊裝置，見(jiàn)圖1。高速冷凍離心機(jī)為Eppendorf產(chǎn)品；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為Tecan Safire產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠為SPF級(jí)，體重(200±20)g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證編號(hào)為SCXK粵2008-0002)。外周血淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊锕井a(chǎn)品；蛋白提取液為碧云天生物公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce；兔抗大鼠FasL單克隆抗體為Epitomics產(chǎn)品；檢測(cè)大鼠CD8和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)的ELISA試劑盒為CusaBio產(chǎn)品。

2方法

2.1顱腦損傷模型制作采用改良的Feeney′s自由落體打擊裝置建立右頂葉局部重型腦挫傷模型(圖1)。大鼠先行右頂骨開窗，直徑為5 mm，保持硬腦膜完整。撞擊錘重量為30 g，高度35 cm，自由落下，撞擊硬腦膜下的腦組織，形成穩(wěn)定的腦挫傷范圍，約為4 mm×4 mm×3 mm大小。假手術(shù)組給予頂骨開窗，但不進(jìn)行腦組織撞擊。外傷后各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的肢體活動(dòng)障礙，且有部分死亡。外傷后存活大鼠納入實(shí)驗(yàn)組，其左側(cè)肢體活動(dòng)障礙均在48 h內(nèi)恢復(fù)正常。

Figure 1.Improved feeney’s free fall hit device (A) and severe brain injury in right parietal lobe (B).

圖1改良Feeney’s自由落體打擊裝置及右頂葉局部重型腦挫傷

2.2動(dòng)物分組SD大鼠飼養(yǎng)在12 h/12 h明暗交替環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食，室溫和相對(duì)濕度分別維持在(22±2)℃和(45±5)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成假手術(shù)組和和TBI組，其中TBI組又分為傷后1 d、3 d、7 d和14 d組。

2.3ELISA測(cè)定TBI后血清中CD8和NSE的含量收集傷后不同時(shí)段大鼠血液，血液凝固后3 000 r/min離心10 min獲取血清樣本。將血清樣本加入酶標(biāo)孔內(nèi)孵育，測(cè)定方法按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照說(shuō)明書，設(shè)定8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度。

2.4Western blot印跡法檢測(cè)FasL的表達(dá)收集大鼠傷后不同時(shí)段血液，抗凝處理后用PBS等體積稀釋血液，使用淋巴細(xì)胞分離液處理后獲取淋巴細(xì)胞。加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液振蕩混勻，超聲裂解，冰浴30 min，后4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清-80 ℃保存。使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V真空電轉(zhuǎn)移1 h)。PBST洗膜5 min。室溫下用含5%脫脂奶粉的PBST封閉PVDF膜1 h。隨后加入抗FasL的I抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗脫3次，加入相應(yīng)的II抗(稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL孵育1 min，暗室中曝光到X光片上。最終掃描分析結(jié)果。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差誤(mean±SEM)表示，兩組間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；同組間不同時(shí)間點(diǎn)的均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)的多重比較。腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)血清NSE和CD8的含量變化采用Pearson積矩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1TBI后大鼠血清中NSE的水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，顱腦外傷術(shù)后1 d血清中NSE的水平即顯著升高，傷后3 d達(dá)到峰值，相比對(duì)照組高出20倍(P<0.01)，隨后逐漸下降，傷后14 d下降至較低水平，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The serum level of NSE at different time points after TBI measured by ELISA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vssham.

圖2TBI后不同時(shí)間段血清NSE的水平

2TBI后大鼠血清中CD8的水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，顱腦外傷術(shù)后3 d血清中CD8水平開始上升，傷后7 d達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，術(shù)后第14 天下降明顯(圖3)。術(shù)后1 d假手術(shù)組和TBI組血清CD8分子水平較高，可能與手術(shù)造成的早期應(yīng)激有關(guān)。

Figure 3.The serum level of CD8 at different time points after TBI measured by ELISA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vssham.

圖3TBI后不同時(shí)間段血清CD8的水平

3TBI后血清中CD8和NSE水平的相關(guān)性

血清CD8的升高滯后于NSE，故將傷后1 d、3 d和7 d的血清NSE對(duì)應(yīng)傷后3 d、7 d和14 d的血清CD8分子進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，從散點(diǎn)圖可見(jiàn)這3個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血清中NSE含量上升與CD8上升呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The correlation of CD8 and NSE in the serum at diffe-rent time points after TBI.

圖4TBI后不同時(shí)間血清中NSE與CD8表達(dá)的相關(guān)性

4TBI后外周血淋巴細(xì)胞FasL的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)顱腦外傷后不同時(shí)間大鼠血液淋巴細(xì)胞FasL蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示傷后1 d、3 d、7 d和14 d的大鼠血液淋巴細(xì)胞中的FasL蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見(jiàn)圖5。

Figure 5.The expression of FasL in the lymphocytes at different time points after TBI determined by Western blot. Means±SEM.n=3.

圖5TBI后不同時(shí)間外周血淋巴細(xì)胞FasL蛋白的表達(dá)

討論

NSE是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞所特有的一種酸性蛋白酶，在脊髓和周圍神經(jīng)節(jié)均有分布，但主要分布于大腦神經(jīng)元。顱腦損傷造成神經(jīng)元、神經(jīng)纖維和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的破壞，尤其是血腦屏障的損傷，使腦內(nèi)特異性神經(jīng)元相關(guān)蛋白釋放入血[3-5]。因此，血液NSE表達(dá)水平升高作為反映腦組織損傷程度的重要指標(biāo)[6]。本研究顯示，大鼠在顱腦損傷后早期(傷后1～3 d)即表現(xiàn)為血清中NSE水平劇烈升高，說(shuō)明腦原發(fā)性創(chuàng)傷造成了神經(jīng)元的直接損傷；隨后(傷后3～14 d)血液NSE水平逐漸下降，反映了機(jī)體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷后的修復(fù)。血清CD8作為CD8+T淋巴細(xì)胞膜抗原主要的廓清形式，其表達(dá)水平反映了血清中CD8+T淋巴細(xì)胞的活性。后者在機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能，其主要作用是特異性直接殺傷靶細(xì)胞。血清CD8在體液中呈均相分布，較T細(xì)胞亞群測(cè)定更精確反映機(jī)體免疫狀況，被視為敏感的免疫激活標(biāo)志。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠顱腦外傷后3 d血清中CD8水平開始升高，7 d達(dá)到峰值，與血清中的NSE相比呈現(xiàn)明顯的滯后性。相關(guān)性分析顯示大鼠傷后1 d、3 d和7 d的血清NSE與傷后3 d、7 d和14 d的血清CD8之間存在正相關(guān)，提示顱腦外傷后血液中CD8增多可能與受損神經(jīng)元釋放NSE入血有關(guān)。胚胎發(fā)育期即存在的血腦屏障使腦組織成為相對(duì)免疫豁免器官，外傷后血腦屏障的破壞使NSE釋放入血，NSE作為特異性抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，大量的CD8+T細(xì)胞在脾臟增殖后進(jìn)入血液循環(huán)。與我們的研究結(jié)果一致的是，在液壓沖擊所致的腦損傷小鼠也表現(xiàn)出傷后外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，而抑制抗原處理和呈遞可逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程[7]。本研究結(jié)果再次證實(shí)外傷后釋放的神經(jīng)組織抗原是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要誘發(fā)因子。

Fas/FasL通路是多種因素引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑[8]。CD8+T細(xì)胞活化后大量表達(dá)FasL，與靶細(xì)胞表面的Fas分子結(jié)合后序列性地啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。本研究顯示顱腦損傷后不同時(shí)間段大鼠血液淋巴細(xì)胞FasL蛋白表達(dá)的差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示顱腦損傷后外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)量盡管增多，卻沒(méi)有明顯活化。分析其原因可能與外周血中缺乏含有特異抗原的靶細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞)，故不能引起淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)和活化。和我們的推論一致的是，閉合性顱腦損傷小鼠傷后7 d腦組織中FasL表達(dá)明顯升高，并伴有白細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明顱腦損傷引起腦內(nèi)淋巴細(xì)胞的活化[9]。本課題組既往研究顯示TBI后大鼠腦組織損傷灶及周邊區(qū)域有大量CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有明顯的神經(jīng)元凋亡[4]。綜上所述，我們推測(cè)，外傷后神經(jīng)組織受損使得大量NSE釋放入血，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致大量CD8+T細(xì)胞在脾臟增殖后進(jìn)入外周血液循環(huán)，損傷的神經(jīng)組織因暴露特異抗原可招募外周血淋巴細(xì)胞至腦損傷灶[10]，活化后引起神經(jīng)元凋亡，成為繼發(fā)性腦損傷的誘因之一。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Variation of CD8 after traumatic brain injury in serum of rats

LI Wei1, ZHENG Ran2, CAI Kang1, ZHENG Kuan1, WANG Zhao-rui1

(1DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510630,China;2TheCenterofClinicalMedicalResearch,HongkongUniversity.Hongkong,China.E-mail:tliwei@jnu.edu.cn)

[KEY WORDS]Traumatic brain injury; Neuron-specific enolase; CD8; FasL

[ABSTRACT]AIM: To explore the character of CD8 after traumatic brain injury (TBI) in peripheral blood. METHODS: Improved Feeney’s free-fall method was used to set up traumatic brain injury model. The levels of neuron-specific enolase (NSE) and CD8 in the serum of the rats were detected by ELISA. The correlation of both NSE and CD8 in the serum was analyzed by Pearson product-moment correlation. The FasL expression in the lymphocytes of peripheral blood was determined by Western blot. RESULTS: The elevated level of CD8 lagged behind the level of NSE in the serum after TBI. The serum level of NSE was significantly increased at the 1st day after TBI and reached a peak at the 3rd day, subsequently gradually decreased to a lower level; the serum level of CD8 was increased at the 3rd day after TBI, and reached a peak at the 7th day, then gradually decreased. The serum levels of NSE at 1st, 3rd and 7th days were positively correlated with the serum level of CD8 at 3rd, 7th and 14th days. However, the FasL expression in the CD8+lymphocytes of peripheral blood showed no variation at different time points after TBI. CONCLUSION: NSE in the serum released from neural tissues after TBI stimulates immune response and induces the augmentation of CD8 in peripheral blood, which may be a cause of secondary injuries in the brain.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1062- 04

[收稿日期]2016- 04- 20[修回日期] 2016- 05- 27

*[基金項(xiàng)目]廣東省科技計(jì)劃 (No. 2014A020212444)

通訊作者△Tel: 020-38688878； E-mail: tliwei@jnu.edu.cn

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.017