白　寧，　羿　菲，　劉　汀，　李小曼

(教育部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110122)

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NMDA受體亞單位NR2D與MOCA相互作用的鑒定*

白寧，羿菲，劉汀，李小曼△

(教育部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110122)

[摘要]目的： 尋找N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體亞單位NR2D的結(jié)合蛋白，為探討NR2D在視網(wǎng)膜興奮性毒性損傷中的作用提供依據(jù)。方法: 構(gòu)建了包含NR2D細(xì)胞內(nèi)C末端的cDNA片段為誘餌質(zhì)粒，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選小鼠腦cDNA文庫，并用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證NR2D與其結(jié)合蛋白之間的相互作用，免疫熒光顯微鏡觀察NR2D和目的蛋白在視網(wǎng)膜中的共表達(dá)。結(jié)果: 酵母雙雜交篩選到細(xì)胞黏附修飾因子(modifier of cell adhesion，MOCA)為NR2D可能的相互作用蛋白，兩者在視網(wǎng)膜有共定位。結(jié)論: MOCA能特異結(jié)合谷氨酸受體NR2D，這為進(jìn)一步研究谷氨酸的興奮性毒性參與視網(wǎng)膜退行性變的機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]NR2D NMDA受體; 細(xì)胞黏附修飾因子； 酵母雙雜交技術(shù)； 蛋白相互作用

谷氨酸(glutamate，Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸受體可分為促離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptor, iGluR)和促代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor, mGluR)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，與突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶、谷氨酸的興奮性毒性、缺血性腦卒中、創(chuàng)傷性顱腦損傷及神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[1-4]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體屬于促離子型谷氨酸受體的一種，包括必需的亞單位NR1、NR2亞單位家族(NR2A～D)和2種NR3亞單位(NR3A～B)[5]。在某些應(yīng)激條件下，如視網(wǎng)膜缺氧缺血，谷氨酸會(huì)大量釋放，過度激活NMDA受體，從而引起鈣離子過度內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[6]。NR2亞單位是NMDA受體功能和特性的主要決定因素，由于NR2A和NR2B廣泛分布于大腦皮層區(qū)域，因此目前大多數(shù)的研究主要集中在包含NR2A/2B的NMDA受體。然而，從離子通道的特性來看，包含NR2D亞單位的NMDA受體具有電阻低、通道開放緩慢、對激動(dòng)劑谷氨酸親和力高和不敏感的鎂離子電壓依賴性封閉等特點(diǎn)[7]，說明此受體通道易被激活、通道開放時(shí)間長，并伴有大量的鈣離子內(nèi)流，從而引起興奮性毒性損傷。本研究旨在應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)和免疫共沉淀的方法篩選可能與NR2D相互作用的新蛋白，為闡明NR2D在視網(wǎng)膜興奮性毒性損傷中的作用及其分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1材料

酵母雙雜交系統(tǒng)(Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System)購自Clontech，包括酵母菌株Y2HGold和Y187、質(zhì)粒pGBKT7和pGADT7、陽性對照和陰性對照質(zhì)粒；小鼠胎腦cDNA文庫、重組質(zhì)?？寺?yīng)用試劑盒In-Fusion?Advantage PCR Cloning Kit、pEGFP C1 和抗GFP抗體均購自Clontech；大腸桿菌DH5α和pEF1/myc-His A購自Invitrogen；大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen；pSP-NR2D cDNA、NR2D抗體和MOCA抗體由本室保存； 抗c-Myc抗體購自MBL；抗Brn3抗體購自Santa Cruz；轉(zhuǎn)染試劑GeneJuice購自Novagen。

2酵母雙雜交

以pSP-NR2D cDNA為模板， PCR擴(kuò)增包含編碼NR2D 細(xì)胞內(nèi)C末端的cDNA片段(895～1323aa)插入pGBKT7載體中獲得誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NR2D CT，并經(jīng)DNA序列測定證實(shí)序列無誤。按照Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)說明，誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌，篩選小鼠胎腦cDNA文庫。同時(shí)進(jìn)行誘餌蛋白自激活和毒性檢測，設(shè)立陽性對照和陰性對照實(shí)驗(yàn)及文庫滴定。將已轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的酵母菌轉(zhuǎn)化子鋪皿于營養(yǎng)缺乏性培養(yǎng)基SD/-Trp(缺色氨酸，SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(缺色氨酸并表達(dá)X-α-半乳糖苷酶，SDO/X)、SD/-Trp/X-α-Gal/aureobasidin A(缺色氨酸并表達(dá)X-α-半乳糖苷酶和抗真菌抗生素篩選，SDO/X/A)。若誘餌蛋白無自激活，則只能在SDO和SDO/X培養(yǎng)基上生長，不能在SDO/X/A培養(yǎng)基上生長，并且β-半乳糖苷酶活性檢測呈陰性。同時(shí)將質(zhì)粒pGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)化入Y2HGold細(xì)胞作為陽性對照，鋪皿于SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/aureobasidin A(缺色氨酸、亮氨酸，并表達(dá)X-α-半乳糖苷酶和抗真菌抗生素篩選，DDO/X/A)培養(yǎng)基上，由于已知P53蛋白和T抗原有互作可以激活報(bào)告基因，因此轉(zhuǎn)化子可以在DDO/X/A培養(yǎng)基上生長，并可使底物X-α-Gal變藍(lán)。觀察含有誘餌質(zhì)粒和空質(zhì)粒pGBKT7的轉(zhuǎn)化子在SDO培養(yǎng)基上的生長，比較克隆大小，以判斷誘餌是否有毒性而導(dǎo)致酵母菌生長緩慢。按照Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)說明，2缺培養(yǎng)基(缺色氨酸、亮氨酸，DDO)、X-α-Gal、aureobasidin A篩選，陽性克隆轉(zhuǎn)4缺培養(yǎng)基(缺腺嘌呤、組氨酸、色氨酸、亮氨酸，QDO)，結(jié)合X-α-半乳糖苷酶和抗真菌抗生素繼續(xù)篩選，能在營養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基上生長且為藍(lán)色的菌落方為陽性克隆。隨機(jī)挑取部分陽性克隆，抽提質(zhì)粒送測序，并在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對序列以確定候選基因。

3免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

HEK293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(Sigma)，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70%時(shí)，按照GeneJuice使用說明將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。NR2D C末端(895～1323 aa)插入pEGFP C1載體中(pEGFP C1-NR2D CT)，從酵母雙雜交篩選出的細(xì)胞黏附修飾因子(modifier of cell adhesion，MOCA)的結(jié)合片段(selected interacting domain，SID)插入pEF1/myc-His A載體(pEF1/myc-His A-MOCA)。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，冰浴RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，1% Nonidet P-40，5 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，0.5% Na-deoxycholate，1 mmol/L PMSF， Complete Protease Inhibitor Cocktail)裂解細(xì)胞。高速離心后取上清，根據(jù)說明加入適量anti-Myc和anti-GFP的磁性瓊脂糖珠(MBL)進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。將蛋白裂解物及免疫沉淀復(fù)合物用上樣緩沖液加熱變性，進(jìn)行Western blot分析。

4免疫熒光染色觀察共定位

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的小鼠品系為C57BL/6J，將生后5周的小鼠乙醚麻醉后用4% 多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)灌流，摘除眼球置于相同的固定液中4 ℃固定2 h，然后放入30%蔗糖溶液中4 ℃過夜，用冰凍切片包埋劑optimal cutting temperature compound (OCT)包埋，冰凍切片機(jī)制備10 μm的視網(wǎng)膜切片。以Brn3抗體(1∶100)標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)，NR2D抗體(1∶50)和MOCA抗體(1∶100)檢測兩者在視網(wǎng)膜的共定位，再以相應(yīng)熒光 II 抗(Alexa Fluro 488和Alexa Fluro 568，購自Invitrogen)孵育，封片，熒光顯微鏡下觀察。

結(jié)果

1酵母雙雜交篩選提示MOCA為NR2D可能的相互作用蛋白

我們構(gòu)建了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NR2D CT，轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold，Western blot分析可見c-Myc標(biāo)記的融合蛋白NR2D-Myc-BD在酵母中正確表達(dá)，大小約62 kD，陽性對照p53-Myc-BD蛋白約57 kD(圖1)。同時(shí)，我們也檢測了誘餌蛋白是否具有自激活活性，將誘餌質(zhì)粒的酵母菌轉(zhuǎn)化子鋪皿于營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基SDO、SDO/X和SDO/X/A，觀察生長狀況，誘餌蛋白沒有自激活活性，只能在SDO和SDO/X培養(yǎng)基上生長，不能在SDO/X/A培養(yǎng)基上生長，并且β-半乳糖苷酶活性檢測呈陰性(結(jié)果未顯示)。在誘餌蛋白的毒性檢測中，我們觀察了含有誘餌質(zhì)粒和空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，酵母克隆的大小相似，克隆的數(shù)量二者無顯著差異，說明誘餌蛋白對酵母生長無毒性作用。用過夜培養(yǎng)的酵母菌Y2HGold/pGBKT7-NR2D CT與酵母菌Y187/小鼠胎腦cDNA文庫進(jìn)行雜交，從篩選到的陽性克隆中我們隨機(jī)選取6個(gè)克隆進(jìn)行測序分析，在GenBank中進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果見表1。其中有2個(gè)克隆是編碼Dock同源區(qū)域2(dock homology region 2, DHR-2)結(jié)構(gòu)域的MOCA。它們的結(jié)合部位位于MOCA的DHR-2結(jié)合域附近，在796～1 154氨基酸內(nèi)。

Figure 1.Expression of NR2D-Myc-BD fusion protein in yeast. Western blot analysis of yeast protein extracts with c-Myc antibody.

圖1NR2D-Myc-BD融合蛋白在酵母菌中的表達(dá)

2NR2D和MOCA可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)相互作用

為了研究NR2D和MOCA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中是否有相互作用，將pEGFP C1-NR2D CT和pEF1/myc-His A-MOCA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，anti-GFP和anti-Myc的磁性瓊脂糖珠純化NR2D和MOCA，用Myc和GFP抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示用Myc抗體檢測anti-GFP的免疫沉淀物可見MOCA SID能與NR2D CT結(jié)合，Myc不與NR2D CT結(jié)合作為陰性對照。反之，用GFP抗體檢測anti-Myc的免疫沉淀物可見NR2D CT能與MOCA結(jié)合，GFP不與MOCA結(jié)合作為陰性對照，見圖2。

Figure 2.Identification of MOCA as an NR2D-interacting protein. HEK293T cells were transfected with plasmids encoding the SID of MOCA (Myc-MOCA SID) and EGFP-tagged NR2D C-terminus (EGFP-NR2D CT). The lysates of transfected cells were immunoprecipitated (IP) with anti-GFP or anti-Myc antibody. Immune complexes were detected by immunoblotting (IB) with anti-Myc or anti-GFP antibody. Total cell lysates used for immunoprecipitation were loaded as input samples. Data are from a single experiment, which is representative of 3 experiments that yielded similar results.

圖2MOCA和NR2D的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

3NR2D和MOCA在小鼠視網(wǎng)膜中共定位

由于谷氨酸的興奮性毒性同青光眼RGCs的退行性變有關(guān)，因此我們檢測MOCA和NR2D在小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)模式。首先應(yīng)用Brn3(RGCs的標(biāo)志物)抗體和NR2D特異性抗體，熒光顯微鏡下觀察可見Brn3顯示綠色熒光，特異性地表達(dá)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)，NR2D顯示紅色熒光，也表達(dá)在GCL，圖片疊加顯示NR2D表達(dá)于Brn3陽性的RGC中。我們應(yīng)用MOCA抗體檢測到MOCA也表達(dá)于GCL，同時(shí)用NR2D抗體標(biāo)記顯示MOCA和NR2D在視網(wǎng)膜的GCL中共定位，見圖3。

Figure 3.NR2D and MOCA both located in the mouse retina. Double-labeling experiments were carried out on mouse retina sections. NR2D (red) was expressed in Brn3-positive cells (green, a marker for RGC). NR2D was green and MOCA was red. MOCA co-located with NR2D in RGCs, as shown in the overlay panel. The scale bar=50 μm. GCL: ganglion cell layer; IPL: inner plexiform layer; INL: inner nuclear layer. Data are from a single experiment, which is representative of 3 experiments that yielded similar results.

圖3MOCA和NR2D共定位在小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

討論

NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的谷氨酸受體之一，過度激活NMDA受體導(dǎo)致神經(jīng)元損傷直至死亡可產(chǎn)生興奮性毒性，這一過程參與了許多眼部疾病的視網(wǎng)膜損傷，如青光眼RGC的死亡。鑒于NR2D亞單位的通道特性及其在視網(wǎng)膜中的豐富表達(dá)，我們首先關(guān)注這一亞單位，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選了小鼠腦cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)NR2D可結(jié)合多種蛋白，其中MOCA是NR2D在胞漿中新的互作分子，它們的結(jié)合部位位于MOCA的DHR-2結(jié)合域附近，后續(xù)通過免疫共沉淀分析也證實(shí)了MOCA能夠特異性地結(jié)合NR2D。

MOCA屬于新型鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)家族成員，有助于小G蛋白上的GDP和GTP相互轉(zhuǎn)換，能特異性地活化Ras和Rho等小G蛋白[8]。MOCA最早是作為早老素結(jié)合蛋白(presenilin-binding protein，PBP)而被人們所認(rèn)知的，參與了細(xì)胞黏附和神經(jīng)元軸突的定向生長[9]。MOCA同阿爾茨海默病相關(guān)，因?yàn)樗軌蛘{(diào)節(jié)Aβ的分泌，在神經(jīng)纖維纏結(jié)中聚集[10-11]。有研究表明，過表達(dá)MOCA能夠促進(jìn)損傷后的視神經(jīng)再生[12]，在原代培養(yǎng)的RGC中過表達(dá)MOCA能夠顯著地抑制谷氨酸的興奮性毒性作用[13]，說明MOCA可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)合上述文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)中MOCA和NR2D的互作并且共定位于小鼠視網(wǎng)膜組織中，提示MOCA可能通過修飾NR2D或者影響NR2D的表達(dá)，從而降低NR2D NMDA受體的興奮性毒性，起到保護(hù)RGC的作用。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Interaction of NR2D subunit of NMDA receptor with MOCA

BAI Ning, YI Fei, LIU Ting, LI Xiao-man

(InstituteofTranslationalMedicine,KeyLaboratoryofMedicalCellBiology,MinistryofEducation,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China.E-mail:lixm@mail.cmu.edu.cn)

[KEY WORDS]NR2D NMDA receptor; Modifier of cell adhesion; Yeast two-hybrid techniques; Protein interaction

[ABSTRACT]AIM: To identify the potential proteins interacting with NR2D subunit of NMDA receptor by yeast two-hybrid screening and to investigate the role of NR2D in excitotoxicity of the retina.METHODS: The Clontech GAL4 yeast two-hybrid system was used to screen the mouse brain cDNA library, and the bait plasmid containing C-terminus of NR2D was constructed. Physical interaction between 2 proteins was verified by co-immunoprecipitation assay. The subcellular localization of 2 proteins in the mouse retina was observed under microscope with immunofluorescence.RESULTS: Modifier of cell adhesion (MOCA) was identified as a new protein interacting with NR2D. MOCA and NR2D were co-expressed in the mouse retina. CONCLUSION: MOCA specifically interacts with NR2D, which provides the experimental basis for identifying the role of glutamate excitotoxicity in the retina neurodegeneration.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1118- 04

[收稿日期]2016- 03- 08[修回日期] 2016- 05- 09

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81300800)；遼寧省博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No. 20131141)；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2013021053)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No. 20151098)

通訊作者△Tel: 024-31939636; E-mail: lixm@mail.cmu.edu.cn

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.026