馬慧萍，景臨林，樊鵬程，何　蕾，賈正平

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5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮的抗氧化及對高原缺氧小鼠的保護作用

馬慧萍，景臨林，樊鵬程，何蕾，賈正平

[摘要]目的對5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮(TMF)的自由基清除及抗高原缺氧作用進行研究。方法采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、羥自由基、超氧陰離子和一氧化氮清除方法評價TMF的抗氧化作用；利用常壓密閉缺氧和低壓性缺氧模型，通過測定缺氧小鼠心肌腦組織自由基代謝相關生化指標評價其抗缺氧活性。結果TMF對4種自由基均表現(xiàn)出一定的清除活性。與缺氧模型組相比，TMF能夠顯著延長缺氧小鼠的存活時間，降低缺氧小鼠心腦組織中丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力(P<0.01)。結論TMF是一種抗氧化活性優(yōu)異的黃酮類化合物，能提高低壓低氧小鼠抗氧化能力，減少自由基的損傷，表現(xiàn)出較好的抗缺氧活性。

[關鍵詞]黃酮；抗氧化；抗缺氧；自由基清除

1材料與方法

1.1藥品與試劑TMF按照本實驗室報道的方法制備[4]；乙酰唑胺(武漢遠城科技發(fā)展有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美國sigma公司)；還原型輔酶I(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、抗壞血酸(Vc)、硫代巴比妥酸(TBA)、硝普鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺和蘆丁(阿拉丁試劑公司)；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2實驗動物清潔級BABL/C雄性小鼠74只，體重18～22 g，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科提供，許可證號：SYXK(軍)2014-0029。

1.3實驗儀器Spectramax i3多功能酶標儀(Molecular Devices公司)；RE-3000A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SK3300L超聲清洗器(上海精密儀器儀表有限公司)；AE204型電子天平(美梅特勒-托利多儀器有限公司)；UV2800SPC紫外可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，F(xiàn)LYDWC50-IIC低壓低氧動物實驗艙(貴州風雷航空軍械有限公司)。

1.4實驗方法

1.4.1DPPH清除實驗：向125 μl不同摩爾濃度的樣品溶液中分別加入0.1 mmol/L DPPH 70%乙醇溶液125 μl，室溫下暗處反應30 min，以70%乙醇溶劑做空白對照，測量其在波長517 nm處的吸光度Ai。將125 μl 70%乙醇溶液分別與DPPH 70%乙醇溶液125 μl和125 μl樣品溶液混合后，測定其在波長517 nm處的吸光度，分別計為A0和Aj。計算其清除率[清除率(%)=(1-Ai-Aj/A0)×100]及拮抗劑半抑制濃度(IC50)。

1.4.2羥自由基清除實驗：向500 μl不同摩爾濃度樣品溶液中依次加入50 μl 28 mmol/L脫氧核糖(溶于pH=7.0的0.2 mmol PBS)、50 μl EDTA(1 mmol/L)、50 μl的FeCl2(1 mmol/L)和50 μl H2O2(1 mmol/L)，最后加入50 μl抗壞血酸(1 mmol/L)啟動反應，37℃水浴孵育1 h后依次加入250 μl三氯乙酸(10%)和250 μl TBA(0.5%，溶于25 mmol/L的NaOH溶液)，沸水中孵育0.5 h，測定532 nm處吸光度Ai，用500 μl蒸餾水代替樣品溶液，測得吸光度A0，用PBS代替脫氧核糖測得吸光度Aj。計算其清除率及IC50。

1.4.3超氧陰離子(O2-)清除實驗：向100 μl不同摩爾濃度的樣品溶液中依次加入50 μl NADH(500 μmol/L，溶解于0.2 mol/L、pH=7.4的PBS中)、50 μl NBT(200 μmol/L)和50 μl PMS(20 μmol/L)。混合均勻后室溫下反應8 min，測定其在560 nm處的吸光度Ai。用100 μl 70%乙醇替代樣品，混合后測定其560 nm處的吸光度A0；用50 μl水取代PMS，混合后測定其在波長560 nm處的吸光度Aj。計算其清除率及IC50。

1.4.4一氧化氮(NO)清除實驗：將100 μl不同摩爾的樣品溶液與100 μl的硝普鈉(10 mmol/L，溶解在磷酸緩沖液中0.05 mol/L，pH=7.4)混合均勻后，室溫下孵育2.5 h，向混合溶液中加入900 μl蒸餾水和0.5 ml對氨基苯磺酸(33%，溶解在20%的乙酸溶液中)，室溫放置5 min，最后加入0.5 ml鹽酸萘乙二胺(0.1% w/v)，室溫放置30 min后，測定540 nm處的吸光度Ai。用磷酸緩沖液代替硝普鈉時測得吸光度Aj，用70%乙醇代替樣品溶液時測得吸光度A0。計算其清除率及IC50。

1.4.5常壓密閉缺氧實驗：將50只雄性BABL/C小鼠隨機分成5組:缺氧模型組、乙酰唑胺組(300 mg/kg)、TMF低、中、高劑量組(125、250、500 mg/kg)，每組10只，連續(xù)灌胃給藥5 d，最后一次給藥60 min后，將小鼠分別放入250 ml廣口瓶內(瓶內含5 g鈉石灰)，密封瓶口，立即開始計時，待小鼠停止呼吸時記錄小鼠存活時間。利用存活時間和延長率評價藥物的抗缺氧作用，確定TMF最佳給藥劑量。延長率=(藥物組存活時間-缺氧模型組存活時間)/缺氧模型組存活時間。

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1.4.6低壓低氧實驗：將24只雄性BABL/C小鼠隨機分成4組:正常組、缺氧模型組、乙酰唑胺組(300 mg/kg)、TMF高劑量組(500 mg/kg )，每組6只。給藥方式同1.4.5。最后一次給藥后，除正常組外，將其他3組置于低壓低氧動物實驗艙中，以100 m/min的速度減壓至模擬8000 m海拔高度，并維持低壓低氧9 h，隨后快速升壓至正常氣壓。立即將小鼠脫臼處死，取大腦和心臟組織，用4℃生理鹽水制成10 %的組織勻漿用于相關生化指標的測定。MDA含量、SOD、CAT和GSH-Px活性測定按照相應的試劑盒說明書進行。

2結果

2.1TMF對DPPH清除作用結果如圖1所示，TMF在0.03125~1 mmol/ml濃度范圍內呈明顯的量效關系，表現(xiàn)出較強的清除DPPH的能力，其活性優(yōu)于陽性藥Vc，與蘆丁相當，其IC50分別為(0.148±0.001)、(0.301±0.002)和(0.152±0.004)mmol/ml。

圖1　TMF對DPPH的清除作用TMF為5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮，DPPH為1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，Vc為抗壞血酸

2.2TMF對羥自由基清除作用從圖2結果可以看出：隨著TMF濃度的升高，其對羥自由基的清除能力逐漸增強，具有明顯的劑量依賴性，經(jīng)計算其IC50為(0.954±0.005)mmol/ml，顯著強于Vc(1.655±0.031)mmol/ml，與蘆丁活性相當(0.944±0.015)mmol/ml。

圖2　TMF對羥自由基的清除作用TMF為5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮，Vc為抗壞血酸

2.3TMF對O2-清除作用從圖3結果可以看出：TMF在低濃度時對O2-清除能力弱于蘆丁，但是在高濃度時強于蘆丁，其在1 mmol/ml時清除率為76.67%。陽性藥Vc在低濃度時的清除率較弱，但是當濃度>0.5 mmol/ml時，清除能力迅速增強，在2 mmol/ml時清除率可以達到72.04%。

2.4TMF對NO清除作用從圖4可以看出TMF和蘆丁在低濃度時，對NO清除能力較Vc強，但是隨著濃度的增加，清除率增長緩慢，當濃度為1 mmol/ml，Vc對NO的清除能力最強，達到了77.07%。不同化合物清除NO的IC50依次為化合物TMF(0.287±0.005)mmol/ml

圖3　TMF對O2-的清除作用TMF為5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮，Vc為抗壞血酸，O2-為超氧陰離子

圖4　TMF對NO的清除率TMF為5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮，Vc為抗壞血酸，NO為一氧化氮

2.5常壓密閉缺氧實驗5組在常壓密閉缺氧實驗下存活時間分別為：缺氧模型組(34.65±0.88)min、乙酰唑胺組(40.12±2.17)min、TMF低、中、高劑量組分別為(35.04±1.69)、(42.13±3.07)和(46.48±3.12)min。與缺氧模型組比較，乙酰唑胺組和TMF中高劑量組均能明顯延長常壓密閉缺氧小鼠的存活時間，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.6TMF對低壓低氧小鼠心腦組織中MDA含量和抗氧化酶的影響結果如圖5和表1所示，與正常組比較，缺氧模型組小鼠心、腦組織MDA含量顯著升高(P<0.01)，SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)；經(jīng)乙酰唑胺和TMF預處理后，缺氧小鼠心、腦組織中MDA含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)，SOD、CAT和GSH-Px活力顯著升高。TMF的效果略優(yōu)于乙酰唑胺，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖5　TMF對低壓低氧小鼠心腦組織中MDA含量和抗氧化酶活性的影響TMF為5，6，7-三羥基-8-甲氧基黃酮，MDA為丙二醛、SOD為超氧化物歧化酶、CAT過氧化氫酶、GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶。與正常組比較，bP<0.01；與缺氧模型組比較，cP<0.05,dP<0.01

表1　TMF對低壓低氧小鼠心腦組織中MDA含量和抗氧化酶活性的影響±s)

3討論

黃酮類化合物是一類重要的、在天然產(chǎn)物中廣泛存在的多酚類天然有機化合物，是體內非常重要的次生代謝產(chǎn)物，也是許多藥用植物的有效成分[5]。研究表明：黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、降血壓和神經(jīng)保護等多種生物活性，而這些有益效應均與其具有的抗氧化活性密切相關[6]。為了闡明TMF的抗氧化活性，本研究考察了TMF對4種經(jīng)典自由基的清除作用。DPPH是一種性質穩(wěn)定的含氮自由基，其醇溶液呈深紫色，通過其顏色的變化可以反應待測物質自由基清除能力[7]。羥自由基是活性氧簇(ROS)中活性最強的自由基，它能夠無選擇性的攻擊DNA、核酸和蛋白質等生物大分子，造成細胞組織損傷[8]。O2-自身活性較弱，但是其能夠在體內轉化成活性更強的H2O2和羥自由基[9]。NO是體內重要的功能分子，在體內發(fā)揮著重要的生理功能。但是過多NO會與O2-反應生成氧化性更強的過氧亞硝酸根離子(ONOO-)，進而損傷組織器官[10]。從文中結果可以看出：TMF對4種自由基均表現(xiàn)出優(yōu)異的清除活性，是一種活性優(yōu)異的抗氧化劑。

自由基是機體正常代謝產(chǎn)物[11]。在正常生理狀態(tài)下，機體通過內源性抗氧化體系(抗氧化酶和非酶抗氧化劑)及時清除生成的ROS，維持自由基代謝的穩(wěn)態(tài)。但當機體處于低壓低氧狀態(tài)時，機體內氧化平衡出現(xiàn)紊亂，代謝產(chǎn)生的ROS無法及時清除，造成ROS蓄積，進而對機體產(chǎn)生損傷。有研究指出：抗氧化劑，例如維生素E和乙酰左旋肉堿等能夠緩解低壓低氧造成的損傷[2-3]。本研究結果也表明：灌胃給藥高、中、低劑量的TMF均能不同程度地延長缺氧常壓密閉缺氧小鼠的存活時間，且呈劑量依賴性，其中，TMF高劑量組的抗缺氧效果顯著優(yōu)于乙酰唑胺組。

大腦和心臟是機體中對低壓低氧環(huán)境最為敏感的器官[12-13]。為了闡明TMF對低壓低氧小鼠的保護作用，本研究對心腦組織中自由基代謝相關生化指標進行了測定。MDA是脂質過氧化的最終產(chǎn)物之一，是反映脂質過氧化程度重要指標[14]。低壓低氧會導致小鼠心腦組織中MDA含量顯著升高，經(jīng)TMF預處理后，小鼠心腦組織中MDA含量顯著降低，表明TMF能夠抑制低壓低氧誘導的脂質過氧化。SOD、CAT和GSH-Px是機體內重要的抗氧化酶系，是機體抵抗氧化應激損傷的第一道防線。SOD通過歧化反應將羥自由基轉化為H2O2。生成的H2O2進而被CAT和GSH-Px清除，三者相互協(xié)同維持機體內自由基代謝的穩(wěn)態(tài)[15]。低壓低氧會導致小鼠心腦組織中SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低，抗氧化系統(tǒng)被破壞，導致自由基代謝紊亂和ROS大量蓄積。TMF能夠提高低壓低氧條件下小鼠心腦組織中抗氧化酶的活性，維持機體內自由基代謝穩(wěn)態(tài)，減少低壓低氧誘導的氧化應激損傷。

綜上所述，5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮表現(xiàn)出優(yōu)異的體外自由基清除活性，是一種高效的抗氧化劑。體內實驗研究表明：5,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮能夠顯著延長常壓密閉缺氧小鼠的存活時間，緩解低壓低氧對小鼠心腦組織的損傷，其機制可能與維持機體抗氧化酶的活性、調節(jié)自由基代謝有關。

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(收稿時間：2015-09-15修回時間：2015-10-20)

·論著·

Protective Effect of 5, 6, 7-trihydroxy-8-methoxyflavone Antioxidant on Mice with Hypobaric Hypoxia

MA Hui-ping, JING Lin-lin, FAN Peng-cheng, HE Lei, JIA Zheng-ping (Key Laboratory of Prevention and Cure for the Plateau Environmental Damage of PLA, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo study free radical scavenging and anti-hypoxia efficiency of 5, 6, 7-trihydroxy-8-methoxyflavone (TMF). MethodsThe antioxidation of TMF was evaluated using 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl radical, superoxide anion and nitric oxide radical scavenging methods. The anti-hypoxic activity of the TMF was evaluated using the normobaric hypoxia and hypobaric hypoxia models by detecting biochemical indexes of free radical metabolism in myocardial brain tissues of mice under hypobaric hypoxia condition. ResultsTMF showed some scavenging effect on four free radicals. Compared with those of hypobaric hypoxia models, TMF could enhance the survival time, decrease the malondialdehyde (MDA) level of brain and increase the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) of mice under normobaric hypoxia of mice under hypobaric hypoxia condition (P<0.01). ConclusionTMF is one of flavonoids with good anti-hypoxic activity, and it can improve the antioxidant capacity and reduce injuries of free radicals with good anti-hypoxic activity in mice under hypobaric hypoxia condition.

[Key words]Flavone; Anti-oxidant; Anti-hypoxia; Free radical scavenging

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.003

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R979.9A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0010-05

[通訊作者]賈正平，E-mail：1026573411@qq.com

[基金項目][作者單位]730050 蘭州，蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科全軍高原損傷防治重點實驗室