宋菊青，施雪濤，王迎軍

(1.華南理工大學 國家人體組織功能重建與修復中心，廣州 廣東 510641)(2.華南理工大學 材料科學與工程學院，廣州 廣東 510641)

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骨膜組織工程的研究進展

宋菊青1，2，施雪濤1，2，王迎軍1，2

(1.華南理工大學 國家人體組織功能重建與修復中心，廣州 廣東 510641)(2.華南理工大學 材料科學與工程學院，廣州 廣東 510641)

摘要：一直以來，由創(chuàng)傷、腫瘤切除和先天畸形引起的臨界性骨缺損的臨床治療都存在極大的挑戰(zhàn)，包括自體骨移植在內的傳統(tǒng)骨缺損治療方法，由于供體不足和免疫排斥反應等問題，已經不足以滿足臨床需求。而組織工程的發(fā)展改變了骨修復的傳統(tǒng)治療模式，基于人工和天然生物材料的各種組織工程復合支架被用于修復受損骨。與此同時，也有越來越多的學者認識到骨膜在骨缺損修復中的重要作用，尤其是組織工程支架的整合性和血管化。除了自體或異體骨膜移植，研究者將組織工程的理念融入到骨膜修復中，從結構和功能上模擬天然骨膜。從組織工程骨膜的不同設計理念出發(fā)，簡單回顧了4類組織工程骨膜的研究進展，包括結構仿生型、微觀結構仿生型、血管化型和外力刺激型，這些將為骨組織工程構建和骨膜深入研究提供理論基礎并開啟新的思路和方法。

關鍵詞：骨缺損治療；骨膜組織工程；微圖案化；血管化

1前言

近年來，由于社會工業(yè)化程度提高，由創(chuàng)傷、腫瘤切除、病理變性和先天畸形引起的骨缺損病例日益增多。據不完全統(tǒng)計，我國每年新增骨損傷病人達300萬例。臨床上通常采用骨移植手術治療骨缺損，傳統(tǒng)的骨缺損治療方法包括：自體骨移植(autografting)[1]、同種異體骨移植(allografting)[2]和異種骨移植(xenografting)。自體骨移植是公認的骨組織修復的黃金標準，但是患者要經受自體組織移植手術創(chuàng)傷的痛苦，而且可移植部位及數(shù)量有限；同種異體骨移植具有良好的組織特性，但存在免疫排斥并有感染病毒及細菌的危險，而且制樣、處理和存儲成本較高，其應用也受到極大限制[3]。組織工程的提出及發(fā)展，為解決這個難題提供了新的思路，改變了骨修復的傳統(tǒng)治療模式。基于各種人工或天然生物材料的組織工程支架的開發(fā)，為骨缺損的臨床治療提供了新的途徑。

骨組織工程的核心是建立細胞與生物材料的三維空間復合體，即具有生命力的活體組織，用以對病損組織進行形態(tài)、結構和功能的重建并達到永久性替代。其基本原理和方法是將體外培養(yǎng)擴增的正常骨組織細胞，吸附于一種生物相容性良好并可被機體吸收的生物材料上形成復合物，并將細胞-生物材料復合物植入骨缺損部位，細胞在生物材料逐漸被機體降解吸收的過程中，形成新的在形態(tài)和功能方面與損傷部位相一致的組織，而達到修復創(chuàng)傷和重建功能的目的[4]。然而，目前所采用的天然或人工合成的骨修復材料在成分和結構上均與天然骨組織存在較大差異，與骨組織間難以達到真正的生物性融合；其降解速度與新骨生長速度難以匹配；材料植入骨缺損部位后，其修復過程基本是一種被動的“充填”過程，缺乏對生理環(huán)境的主動感知。并且，骨組織細胞構建的骨修復材料由于內部缺乏血管，往往存在細胞營養(yǎng)供給不足，內部組織易壞死，長期療效差等缺點。

理想的骨缺損修復是工程化的骨替代物能夠與宿主骨組織整合并且恢復缺損的生理學結構和功能。就骨的生理機能而言，除了其他重要因素的參與，骨膜在骨形成和缺損治療中起到了決定性的作用。骨膜是高度血管化的組織，其中含有成骨和成軟骨祖細胞以及其他相關的生物活性因子，而被描述成血管化較好的“骨/軟骨器官”，它為骨提供血液循環(huán)，被認為是骨的“臍帶”，骨膜剝落通常會破壞骨的動脈營養(yǎng)供應[5-7]。骨膜是由微血管化的致密結締組織組成的，它通過夏貝氏纖維(Sharpey’s fibers，也稱貫通纖維)緊緊地覆蓋在皮質骨外表面，形成一層薄而堅韌的膜[8]。從組織結構上講，骨膜被分成不同的兩層：由成纖維細胞和夏貝氏纖維組成的外層纖維層，以及含有多能間充質干細胞和骨母細胞的內層生發(fā)層，這些細胞有助于正常骨的生長、愈合和再生[9-13]。盡管自體和異體骨膜移植已經用于各種尺寸的骨缺損修復，但是骨膜移植仍然存在供體不足、供區(qū)并發(fā)癥和免疫學問題，因此，研究者將組織工程的概念引入到骨膜中，期待能夠更好地解決骨缺損修復的臨床難題。

本文從組織工程骨膜的不同設計理念，簡單回顧了其發(fā)展過程，包括宏觀和微觀的結構仿生以及血管化和力學應答的功能仿生等，期待為后續(xù)的研究提供基本的思路和方法。

2結構仿生組織工程骨膜

骨膜植入物能夠提供骨祖細胞和屏蔽瘢痕組織而有助于骨修復，然而，這些植入物存在著固體不足和供體并發(fā)癥等問題。Sch?nmeyr等采用人脫細胞真皮和成骨細胞/間充質干細胞(MSCs)合成了骨模樣材料[14]。體外結果顯示，成骨細胞更樂于在人脫細胞真皮上黏附和增殖。另外，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的刺激下，成骨細胞表現(xiàn)出分化的潛能。生長在人脫細胞真皮上的細胞能夠有效地被腺病毒轉染，且沒有明顯的細胞毒性。Sch?nmeyr等也對細胞傳遞性和骨形成潛能進行了體內評價，他們將帶有綠色熒光蛋白(GFP)的MSCs接種在人脫細胞真皮上，并用BMP-2轉染，之后將這一結構纏繞在同源小鼠的內收肌上，并植入到裸鼠下頜進行臨界性骨缺損治療。三周之后，帶有GFP的細胞仍然存在，且新骨取代了肌肉和植入結構的界面，六周之后，臨界性骨缺損被成功地治療。這一研究表明，人脫細胞真皮能夠用于合成組織工程骨膜，且可以傳遞細胞和骨誘導蛋白。

Zhou等將由豬骨髓間充質干細胞(BMSCs)組成的細胞層和由醫(yī)用級聚己內酯-磷酸鈣(mPCL-CaP)構成的完全連通支架組裝，制備具有一定結構和功能的骨植入物[15]。他們從細胞培養(yǎng)板中收集BMSCs層并將其包裹在預接種的mPCL-CaP復合支架。培養(yǎng)8周之后發(fā)現(xiàn)，細胞層與支架/細胞結構很好地整合且保持細胞活性，在支架的內部和外部均出現(xiàn)了礦化的節(jié)結。堿性磷酸酶活性(ALP)和骨相關蛋白表達的檢測表明，支架/細胞結構中的細胞經歷了常規(guī)的體外成骨分化。在體內實驗中，他們分別將兩組不同的細胞層-支架/細胞結構植入裸鼠皮下。其中，第一組結構(5×5×4 mm3)與BMSCs層組裝，并在植入前體外培養(yǎng)8周，而第二組結構(10×10×4 mm3)與BMSCs層組裝后并沒有進一步體外培養(yǎng)，則是直接植入體內。結果顯示，兩組結構中均形成了新的血管化的疏松皮質骨，體積將近40%。組織學和免疫組織化學檢測表明，新的骨組織從接種的BMSCs區(qū)域形成，且主要以軟骨內成骨方式為主形成編織骨基質，最后成熟為完全礦化的致密骨，呈現(xiàn)出天然骨的組織學標記物。這一研究表明，將BMSCs層技術與具有優(yōu)化的力學、營養(yǎng)物質運輸和血管化性能的復合支架相結合，可以再生類似于天然骨的大塊骨組織。

骨膜和其中的干細胞群可以調整骨缺損愈合，而這在異體移植中是缺乏的。因此，如何提高同種異體移植的愈合和整合，是研究者亟待解決的問題。Hoffman等利用可水降解的水凝膠將間充質干細胞(MSCs)傳遞和集中到異體移植物表面來制備骨膜類似物，即組織工程骨膜[16]。結果顯示，植入16周后，與未處理的同種異體移植物相比，組織工程骨膜提高了移植物血管化(約2.4倍)、軟骨內骨形成(約2.8倍)和生物力學強度(約1.8倍)。與自體移植相比，組織工程骨膜盡管增強了愈合，卻推遲了軟骨內成骨的過程，因此，研究者認為，在臨床應用前，還需要對這種組織工程骨膜進行改善。例如，將這種自下而上的生物材料制備方法所得到的工程骨膜與相關的細胞種類、基質和小分子藥物結合來加快骨化過程。

3微觀結構仿生組織工程骨膜

盡管結構仿生組織工程骨膜改善和提高了同種異體移植和人工支架再生，但是這些工程骨膜只是在宏觀上類似于天然骨膜，在表面形貌和微觀結構卻與天然骨膜存在很大的差異性。Shi等采用表面微圖案化技術，將骨膜的天然表面形貌和微觀結構融入到組織工程骨膜和骨的設計理念，創(chuàng)新性地提出了簡單易操作的仿生方法。前期研究中，他們用骨膜作為模板將其精致的納米/微米形貌復制在膠原膜表面，使膠原膜表面繼承了骨膜精確的溝槽微圖案拓撲結構，從而，可以更有效地指導細胞沿著天然骨膜的方式取向[17]。之后，他們采用凍干技術，將載有人骨髓間充質干細胞和人真皮微血管內皮細胞的膠原膜(偽骨膜)與納米生物活性玻璃復合形成三維多孔支架，來研究偽骨膜對骨生成的作用。結果顯示，相比于未處理的支架，覆蓋有偽骨膜的支架表現(xiàn)出明顯的成骨性，說明偽骨膜在骨再生中起到了重要的作用。這一研究不僅為骨組織工程支架構建提出了新的理念，也為骨膜研究提供了新的方法。

考慮到骨膜表面的多級拓撲結構，為了使人造骨膜更有效地固定在或與骨支架(如自體移植、同種異體移植和人造多孔支架)整合，Shi等采用微圖案化技術在PLGA 納米片上創(chuàng)造拓撲結構，以調控細胞核細胞外基質的取向類似于天然骨膜[18]。他們將旋涂和微圖案化技術結合制備了富有彈性的、具有多種圖案的“便簽樣”PLGA納米片，用帶有溝槽微圖案化的PLGA納米片模擬天然骨膜用于骨修復治療。值得一提的是，這種獨立的納米片能夠穩(wěn)固地固定在多種骨修復組織工程支架上，并保持表面拓撲形貌。這些微圖案化的納米片能夠黏附在各種支架和植入物上，且在水環(huán)境下也具有高穩(wěn)定性和粘合性。這一獨特的性能使得載有細胞的納米片在體外培養(yǎng)和體內植入時都能固定在多種骨植入物上。另外，他們用覆蓋有微溝槽化納米片的鈦塊研究干細胞的骨生成。結果表明，覆蓋有微溝槽化納米片的鈦塊有效地促進了干細胞成骨標記物的表達。這一研究表明，微圖案化的“便簽樣”PLGA納米片可以為組織工程骨膜再生提供穩(wěn)定的仿生模板，并用于骨修復和生物學研究，同時也說明組織工程應用中仿生骨膜的發(fā)展將提供骨再生治療的新策略。

4血管化組織工程骨膜

正如前面所提到的，天然骨膜中含有豐富的血管組織，為骨膜提供氧氣和營養(yǎng)物質，因此，如何在組織工程骨膜中引入新的血管，以便在骨缺損區(qū)域形成血管化的骨組織，實現(xiàn)功能上仿生天然骨膜，是研究者急需解決的另一問題。Fan等將骨髓間充質干細胞(BMSCs)和二氯化鈷(CoCl2，低氧模擬試劑)處理的BMSCs結合，體外構建了組織工程骨膜[19]。通過體外實驗測試內皮細胞特定標記基因(VEGF/PEDF)的表達，發(fā)現(xiàn)低氧模擬試劑CoCl2處理的BMSCs 表現(xiàn)出較高的VEGF(助血管生成)和較低的PDEF(抗血管生成) 表達。另外，他們將這一工程骨膜植入嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的皮下(2周)和顱骨缺損(4周)，用micro-CT、組織形貌學和免疫組織化學方法來評價異位和正位骨生成和血管生成。研究結果顯示，二氯化鈷預處理的BMSCs 誘導了更高的血管化程度并增強了骨生成。這一研究為增強組織工程骨膜中血管化的骨形成提供了新方法。

為了更好地解決合成支架治療大的骨缺損存在血管化不足的問題，Kang等通過結合血管化的仿生細胞層工程骨膜(CSEP) 和生物可降解的多孔β-TCP 支架來構建血管化的骨移植物[20]。首先，體外培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞(hMSCs) 形成細胞層，然后將人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs) 接種在未分化的hMSCs 層形成血管化的細胞層來模擬天然骨膜的纖維層，同時經過體外培養(yǎng)形成礦化的hMSCs 層來模擬天然骨膜的生發(fā)層；之后，將礦化的hMSCs 纏繞在圓柱形的β-TCP 支架；最后，將血管化的HUVEC/hMSCs 層纏繞在其上，這樣就在β-TCP 支架上形成了仿生的CSEP。以非骨膜結構細胞層包裹的β-TCP 和未處理的β-TCP 作為實驗組，進行體內和體外研究。體外結果顯示，未分化的hMSCs層促進了HUVECs 形成豐富的毛細管裝網絡。體內結果顯示，仿生CSEP 增強了體外預成型的人毛細網絡與宿主小鼠脈管系統(tǒng)之間的血管生成和功能融合。另外，與其他組相比，Micro-CT 分析和骨鈣蛋白染色顯示仿生的CSEP/β-TCP 移植物形成了更多的骨基質。這些結果表明，模擬骨膜細胞內成份和空間構象的CSEP 在血管生成和骨生成中起到了決定性的作用。這一研究表明仿生骨膜包裹的β-TCP 支架在骨再生中是非常有前景的。

5外力刺激組織工程骨膜

已經有大量研究表明，由縱向組裝的細胞和膠原纖維構成的骨膜內層，即生發(fā)層，對骨的生長、重構和骨折修復是非常重要的[21-23]。存在于這一層的干細胞是高度力學敏感的，其一旦受到力學刺激，將改變多種信號分子的產物[10, 24-25]。為了模擬骨膜并促進干細胞向成骨表型分化，將力學和拓撲信號結合，來構建能夠調控細胞形貌和行為(增殖和分化)的支架是很有必要的[26-28]。Shi等通過模擬骨膜微環(huán)境，將力學和拓撲信號結合起來，體外構建能夠誘導干細胞成骨的支架[29]。首先，他們采用表面改性技術構建了聚多巴胺涂敷的石蠟膜，結果顯示，生長在其上的細胞能夠很好地黏附和增殖。另外，由于石蠟膜具有很好的可塑性和延展性，很容易產生微圖案來調控細胞的空間取向并施加不同的力學應力。因此，他們構建了溝槽微圖案化的聚多巴胺涂敷的石蠟膜來誘導干細胞的成骨分化。結果顯示，與沒有拉伸作用的細胞相比，生長在聚多巴胺改性石蠟膜的脂肪間充質干細胞表現(xiàn)出更高的成骨性能，而這正是細胞對力學和空間信號的應答。這一研究將為再生醫(yī)學應用中的干細胞誘導成骨和體外骨生成中的骨膜分化研究開啟新的時機。

6結語

目前，對于組織工程骨膜的研究已經取得了一定的成果，研究者主要從骨膜的宏觀結構、微觀結構、血管化以及力學應答等方面來仿生構建組織工程骨膜，并在體外和體內進行大量的研究實驗，驗證工程骨膜的性能，完善其在骨缺損修復中的作用。但是，對于骨膜微觀結構和生物學功能的仿生研究還處于初始階段，無論是材料選擇、設計理念和性能評價，都需要學者更加深入、系統(tǒng)的研究，進一步完善其理論基礎和建立可行的體內模型，以滿足骨缺損修復的臨床需要。

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(編輯惠 瓊)

收稿日期：2015-10-30

基金項目：廣東省自然科學基金青年基金(2016A030306018)

通訊作者：施雪濤，男，教授，博士生導師，Email:

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2016.06.10

中圖分類號：R318

文獻標識碼：A

文章編號：1674-3962(2016)06-0461-04

Research Development of Periosteum Tissue Engineering

SONG Juqing1，2, SHI Xuetao1，2, WANG Yingjun1，2

(1.National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction,South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)(2.School of Materials Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

Abstract：Always, the clinical therapy of critical-sized bone defects caused by trauma, tumor removal surgery and congenital malformation undergoes great challenges. The traditional treatments for bone defects, including autografting, are unable to meet the clinical needs because of the shortage of donors and immunological rejection. The development of tissue engineering changes the traditional treatment modes, and various tissue engineering cell-biomaterial composite scaffolds based on synthetic and natural biomaterials have been implemented to reconstruct injured bone. At the same time, more researchers are aware of the important role of periosteum in the bone defect healing, especially the integration and vascularization of the scaffold materials. Except the periosteum grafts (auto-or allo-), researchers also provide a biomimetic methodology that integrates the concept of tissue engineering into the periosteum repair. A variety of periosteum tissue engineering have been proposed, which biomimic the native periosteum from structure or function. Here we simply review four types of functional tissue engineering periosteum, including structure biomimic, micro-structure biomimic, vascularization and mechanical stimulation, which would provide theoretical basis and open new opportunities for the construction of bone tissue engineering and the research of periosteum.

Key words：bone defect healing; periosteum tissue engineering; micropatterning; vascularization

第一作者：宋菊青，女，博士研究生.

shxt@scut.edu.cn