聞鄭峰，朱　君，管　軍，姚燕杰，劉　恬，何丹農(nóng)，林兆奮

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院急救科，上海 200003)(2. 納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心，上海 200241)

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氟碳乳劑的制備及其對(duì)機(jī)體供氧能力研究

聞鄭峰1，朱君2，管軍1，姚燕杰2，劉恬2，何丹農(nóng)2，林兆奮1

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院急救科，上海 200003)(2. 納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心，上海 200241)

摘要：探究了以人工肺表面活性物質(zhì)(APS)為載體的氟碳乳劑對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)生長(zhǎng)的影響以及通過肺部給藥后對(duì)海水淹溺動(dòng)物肺部氧合能力的改善情況。制備得到了分散性較好的氟碳乳劑，其平均粒徑為46.62 nm。通過核磁共振及離子色譜證明了氟碳成功地包封其中，氟碳的含量為23.54%。通過A549細(xì)胞共孵育實(shí)驗(yàn)，證明了氟碳乳劑能在1%氧濃度下較明顯地促進(jìn)A549細(xì)胞增殖；當(dāng)氟碳乳劑濃度為5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)124%，而在正常氧濃度下，其對(duì)A549細(xì)胞增殖無明顯作用。實(shí)驗(yàn)兔的海水淹溺模型實(shí)驗(yàn)證明了，海水淹溺實(shí)驗(yàn)兔氟碳乳劑肺部給藥后血氧分壓迅速恢復(fù)，氟碳乳劑具有一定改善動(dòng)物肺部氧合的能力。氟碳乳劑在低氧下能促進(jìn)A549細(xì)胞增殖，通過肺部給藥后對(duì)海水淹溺動(dòng)物肺部氧合能力有一定的改善，這說明其在通過肺部給藥來改善肺部通氣應(yīng)用中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：全氟化碳；人工肺表面活性物質(zhì)；細(xì)胞增殖；肺部氧合

1前言

目前，研究較多的載氧體主要包括血紅蛋白、氟碳化合物、合成血紅素及其高分子配合物[1]。其中，氟碳化合物(Perfluorocarbon，PFC)是一種具有廣泛的生物醫(yī)學(xué)用途的大家族化合物。它具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)具有良好的溶解氣體的功能，可以作為氧氣和二氧化碳的運(yùn)載體，但由于其不溶于水及生物體液，不能直接應(yīng)用于生物體，所以必須乳化以后才能使用。目前，氟碳乳劑已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，其在人工血液、診斷造影、肺部通氣等方面獲得了大量的關(guān)注[2-4]，例如，Pisani 等采用包封全氟溴辛烷(PFOB)的聚合物球囊為超聲和磁共振成像的雙模態(tài)造影劑[5]。Bauer 等將氟碳包封在聚合物納米球或微球中作人工氧載體，用作血液替代品[6]。然而，目前對(duì)于氟碳的研究多數(shù)停留在了實(shí)驗(yàn)階段，無法實(shí)現(xiàn)其真正的應(yīng)用，所以，對(duì)于氟碳及氟碳乳劑的研究依然值得關(guān)注。

肺部是機(jī)體的開放性器官，作為蛋白多肽類藥物的給藥部位具有吸收面積大，血容量豐富，生物酶活性低等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。肺泡表面活性物質(zhì)(Pulmonary Surfactant，PS)是存在于正常肺泡內(nèi)表面的一種能減弱肺泡表面張力的物質(zhì)。這是一種以磷脂為主要成分的脂質(zhì)和表面活性蛋白混合物，在肺泡表面具有獨(dú)特的鋪展功能和動(dòng)態(tài)表面張力，能夠降低肺泡表面張力，穩(wěn)定肺泡，防止呼吸末期肺泡萎陷，以及免疫調(diào)節(jié)和器官保護(hù)特性，治療肺部疾病[9-11]。在臨床上，人工肺表面活性物質(zhì)(Artificial Pulmonary Surfactant，APS)制劑已被用于治療肺部疾病或原發(fā)性疾病繼發(fā)所引起的急性呼吸衰竭。APS主要借助于與天然的PS相似的生理功能，彌補(bǔ)病理狀態(tài)下機(jī)體自身PS成分、含量及異常所致的肺損傷，減輕肺功能障礙和支氣管阻塞程度，緩解和改善病情。目前，利用APS為載體包載氟碳來作為肺部供氧材料的研究尚未見報(bào)道。

本文以二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、蛋黃卵磷脂為主要磷脂成分，添加四丁酚醛等表面活性劑來制備APS[12-13]，并以其為載體，全氟溴辛烷(PFOB)為載氧體制備了APS/PFOB乳劑。并探究其對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)生長(zhǎng)的影響以及通過肺部給藥后對(duì)海水淹溺模型氧合的改善。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1試劑

二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC，百靈威)、蛋黃卵磷脂(上海三杰生物技術(shù)有限公司)、全氟溴辛烷(PFOB，Sigma)、甘油(AR，國(guó)藥)、維生素E(AR，國(guó)藥)、四丁酚醛(阿拉丁)、胎牛血清(Gbico)、F-12K培養(yǎng)基(Gbico)、青-鏈霉素(Gbico)、CCK-8(北京泛博生物化學(xué)有限公司)。

2.2儀器

S25-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)、超純水機(jī)(Hitech，美國(guó))、勻漿機(jī)(IKA，德國(guó))、IMark酶標(biāo)儀(Bio-rid，美國(guó))、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))、三氣培養(yǎng)箱(長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司，中國(guó))、核磁共振儀(Bruker，德國(guó))、納米激光粒度儀(Malvern，英國(guó))、透射電子顯微鏡(JEOL，日本)、離子色譜儀(Dionex 500，美國(guó))。

2.3氟碳乳劑的制備

取60 mg DPPC、60 mg蛋黃卵磷脂、10 mg維生素E、8 μL甘油、6 μL四丁酚醛與2 mL PBS(pH=7.4)混合，將其置于恒溫磁力攪拌器上，在40 ℃下攪拌至無明顯塊狀物時(shí)，冷卻至室溫，呈懸濁液狀態(tài)。在反應(yīng)液中加入PFOB，在室溫下采用勻漿機(jī)進(jìn)行攪拌(4檔)，攪拌1 min停1 min，間歇進(jìn)行，往復(fù)1～3 h。之后將其置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜，棄去下層沉淀，取上清液于離心機(jī)中離心3 min，轉(zhuǎn)速2000 rpm，結(jié)束后取上清液即可[13]。

2.4乳劑的表征

將乳劑稀釋5倍，利用馬爾文激光粒度儀檢測(cè)乳劑的粒徑分布。透射電鏡觀察時(shí)，將乳劑稀釋后滴至銅網(wǎng)，再用鑷子將銅網(wǎng)捏住浸入4%的磷鎢酸溶液中40～50 s，然后取出烘干即可。離子色譜檢測(cè)采用氧瓶燃燒法，分離柱：IonPac AG14-AS14，檢測(cè)方式：電導(dǎo)，淋洗液：NaHCO30.0010 M+Na2CO30.0035 M，檢測(cè)前先將樣品凍干即可。19F核磁共振檢測(cè)時(shí)，將樣品凍干后重溶于氘水檢測(cè)即可。

2.5細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌細(xì)胞(A549)培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基。細(xì)胞傳代：吸出培養(yǎng)基，用無菌PBS洗一遍，加入0.25%胰酶1 mL消化細(xì)胞，等到細(xì)胞變圓后加入1 mL培養(yǎng)基吹打，以1000 r /min離心細(xì)胞懸液3 min，倒掉上層液體，再加入1 mL培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻，一傳二接種至培養(yǎng)皿中。

2.6氟碳乳劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響

將A549細(xì)胞消化離心后以5000/孔接種于96孔板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，吸出培養(yǎng)基，每一列以6孔為單位，加入含有不同濃度氟碳乳劑的培養(yǎng)基，濃度分別為0.04、0.08、0.15、0.3、0.6、1.2、2.5、5 mg/mL，陰性對(duì)照組中只加F-12K培養(yǎng)基。分別在正常氧濃度和1%氧濃度下培養(yǎng)12 h，之后吸出培養(yǎng)基，加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基，在未接種細(xì)胞的一組空白孔也加入含CCK-8的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，在37 ℃下孵育4 h[14- 15]。用IMark酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A值)，計(jì)算出各組吸光度的均值，以陰性對(duì)照組的吸光度值作為100%的細(xì)胞增殖率，不同濃度及條件組的細(xì)胞增殖率依據(jù)以下公式求出：P%=(各組A均值-空白組A值)/(陰性對(duì)照組A均值-空白組A值)×100%。

2.7體內(nèi)供氧實(shí)驗(yàn)

建立實(shí)驗(yàn)兔海水淹溺缺氧模型，通過肺部給藥，探究氟碳乳劑對(duì)動(dòng)物氧合的作用效果。將實(shí)驗(yàn)兔分為兩組，分別進(jìn)行海水淹溺的建模，每只實(shí)驗(yàn)兔(約2 kg)從氣道灌注海水，1.2 mL/min，持續(xù)5 min。海水灌注完后30 min進(jìn)行給藥處理。對(duì)照組從氣道滴注0.9% NaCl溶液，實(shí)驗(yàn)組滴注APS/PFOB乳劑，觀察實(shí)驗(yàn)兔的腿動(dòng)脈處的血氧分壓變化(PO2)。采用3%的戊巴比妥鈉麻醉，注射劑量為2 mL/kg。氣道滴注給藥的速度為0.5 mL/min，最終給藥量為1 mL/kg。

2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果通過均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢查的方式比較各組的均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P值小于0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3結(jié)果與討論

圖1　 氟碳乳劑的粒徑分布(a)和TEM照片(b)Fig.1　Size distribution (a) and TEM image(b) of APS/PFOB emulsion

圖1a為乳劑的水合粒徑分析結(jié)果，其平均水合粒徑46.62 nm，且分布較為集中。從圖1b可以看出乳劑粒徑普遍在40 nm左右，單分散性很好，幾乎所有納米球都是單獨(dú)存在，未出現(xiàn)團(tuán)聚。納米乳劑的粒徑與分散性對(duì)其保存和應(yīng)用有著重要的意義，較小的粒徑及較好的單分散性有利于其生物學(xué)的應(yīng)用，能更容易被生物體吸收產(chǎn)生作用，也有利于其長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定保存。

為證明乳劑中成功包載了PFOB，我們對(duì)乳劑進(jìn)行了19F核磁共振檢測(cè)。如圖2所示，在化學(xué)位移為6左右的位置，出現(xiàn)了3個(gè)較強(qiáng)的19F的峰，分別對(duì)應(yīng)PFOB中氟元素的3種不同化學(xué)環(huán)境，這證明了PFOB被成功地包載在乳劑之中。此外，通過離子色譜的檢測(cè)，定量地表征了材料中PFOB的載藥量。樣品凍干后離子色譜的檢測(cè)結(jié)果為，F(xiàn)含量為15.24%，經(jīng)過換算可得出，PFOB的含量為23.54%。

圖2　 APS/PFOB乳劑的19F核磁共振圖譜Fig.2　19F NMR spectrum of APS/PFOB emulsion

為探究APS/PFOB乳劑對(duì)不同條件下細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，我們檢測(cè)了1%氧濃度和正常氧濃度下，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響的區(qū)別。如圖3所示，在1%氧濃度下乳劑與細(xì)胞共孵育12 h后，細(xì)胞增殖率隨著氟碳乳劑濃度的提高而升高，與對(duì)照組均有明顯差異(P < 0.05),在濃度為0.04～0.6 mg/mL時(shí)升高較快，之后趨于平緩，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)到了124%。而在正常氧濃度下共孵育的細(xì)胞增殖率有較大波動(dòng)，無明顯的變化趨勢(shì)。從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，在1%氧濃度下培養(yǎng)時(shí)，由于環(huán)境中缺少氧氣， PFOB中溶解的氧氣釋放至培養(yǎng)基，被細(xì)胞吸收，促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞乳劑濃度越高，含氧量也就越多，對(duì)細(xì)胞的促進(jìn)作用越明顯。而在正常氧濃度下培養(yǎng)時(shí)，環(huán)境中本身不缺少氧氣，氟碳乳劑的存在并不能起到明顯的作用，甚至由于乳劑的添加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響，使其增殖率出現(xiàn)波動(dòng)。

圖3　 APS/PFOB乳劑與A549細(xì)胞在1%氧濃度(a)和正常氧濃度下(b)孵育12 h后細(xì)胞增殖情況；*代表相比于對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)Fig.3　A549 cell proliferation after incubated with APS/PFOB emulsion for 12 h under the condition of 1% oxygen concentration and normoxia, respectively. * indicates significant differences compared to the control group (P < 0.05)

為進(jìn)一步探究氟碳乳劑的體內(nèi)供氧能力，我們采用實(shí)驗(yàn)兔的海水淹溺模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)兔正常呼吸時(shí)其血氧分壓(PO2)為在100 mmHg左右，在灌注海水以后其血氧分壓急速下降至40 mmHg左右，并且在半小時(shí)后依然無明顯變化，這可能是由于海水淹溺不僅造成了窒息，也對(duì)肺部造成了無法快速恢復(fù)的損傷，導(dǎo)致肺部氧合能力下降。而在給藥后，實(shí)驗(yàn)兔的血氧分壓逐漸恢復(fù)，特別是在60 min左右的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)最為迅速，最終血氧分壓穩(wěn)定在100 mmHg左右。而滴注生理鹽水的對(duì)照組，其血氧分壓恢復(fù)緩慢，最終只穩(wěn)定在了60 mmHg左右的位置。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明氟碳乳劑能夠改善海水淹溺后的肺部氧合能力，幫助動(dòng)物更快地恢復(fù)血氧分壓。作者認(rèn)為氟碳乳劑的這一效果，既得益于氟碳本身的載氧能力，也得益于我們采用人工肺表面活性物質(zhì)作為載體，其有助于改善肺部的氧合能力。

圖4　 海水淹溺模型的實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)APS/PFOB乳劑肺部給藥后血氧分壓變化Fig.4　PO2 changes of seawater drowning rabbits after APS/PFOB emulsion pulmonary delivery

4結(jié)論

本文采用高速乳化法，以人工肺表面活性物質(zhì)為載體，制備得到了分散性較好的氟碳乳劑，其平均粒徑為46.62 nm。通過核磁共振及離子色譜證明了氟碳成功地包封其中，氟碳的含量為23.54%。此外，通過A549細(xì)胞共孵育實(shí)驗(yàn)，證明了氟碳乳劑能在1%氧濃度下較明顯地促進(jìn)A549細(xì)胞增殖，當(dāng)氟碳乳劑濃度為5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖率達(dá)124%，而在正常氧濃度下，其對(duì)A549細(xì)胞增殖無明顯作用。通過實(shí)驗(yàn)兔的海水淹溺模型實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，證明了氟碳乳劑具有一定改善動(dòng)物肺部氧合的能力，這說明其未來有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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(編輯惠 瓊)

收稿日期：2015-09-30基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2014BAK05B02); 國(guó)家自然科學(xué)基金(51303135); 閔行區(qū)民生科技項(xiàng)目(2014 MH089)

通訊作者：林兆奮，男，1964年生，教授，博士生導(dǎo)師，Email:

DOI:10.7502/j.issn.1674-3962.2016.06.09

中圖分類號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-3962(2016)06-0457-04

The Preparation of Perfluorocarbon Emulsion and Its Ability of Oxygen Supply to Organism

WEN Zhengfeng1, ZHU Jun2, GUAN Jun1, YAO Yanjie2, LIU Tian2,HE Dannong2,LIN Zhaofen1

(1. Department of Emergency, Changzheng Hospital, The Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)(2. National Engineering Research Center for Nanotechnology, Shanghai 200241, China)

Abstract：Artificial pulmonary surfactant (APS)/Perfluorocarbon (PFC) emulsion using APS as a carrier is prepared through high-speed emulsification, the effect of APS/PFC emulsion on cell proliferation and its ability of improving pulmonary oxygenation to seawater drowning rabbits are explored. PFC content of APS/PFOB freeze-dried powder is 23.54%. A549 cell viability is increased gradually with the increasing concentration of APS/PFOB emulsion under condition of 1% oxygen concentration. About 124% cell proliferation rate is maintained when the concentration is 5 mg/mL. Moreover, it is demonstrated that APS/PFOB emulsion can improve pulmonary oxygenation to seawater drowning rabbits through pulmonary delivery. APS/PFC emulsion has abilities of promoting A549 cell proliferation during hypoxia and improving pulmonary oxygenation to seawater drowning rabbits through pulmonary delivery, it has potential application for improving lung ventilation.

Key words：perfluorocarbon; artificial pulmonary surfactant; cell proliferation; pulmonary oxygenation

第一作者：聞鄭峰，男，1989年生，碩士研究生

linzhaofen@sina.com