汪順才 馬潔 朱夢琪 馬久明 周華 虞臘青 楊永峰 經(jīng)繼生

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GPC3、GP73在肝細(xì)胞癌臨床診斷中的價(jià)值

汪順才 馬潔 朱夢琪 馬久明 周華 虞臘青 楊永峰 經(jīng)繼生

目的 評價(jià)磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高爾基體蛋白73(GP73)的高表達(dá)對肝細(xì)胞癌(HCC)診斷價(jià)值。方法對39例HCC、31例肝硬化患者，基線時(shí)收集外周血及肝組織，采用ELISA法檢測血清GPC3、GP73的表達(dá)量，實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法(qRT-PCR)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及肝組織中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相對表達(dá)量；ROC曲線分析診斷的靈敏度、特異度等指標(biāo)。結(jié)果HCC組GPC3、GP73測量值顯著高于肝硬化組(P<0.001)；GPC3診斷HCC的截?cái)嘀? 9.3 μg/L，ROC曲線下面積(AUC)=0.956，靈敏度為89.74%，特異度為96.77%，陽性預(yù)測值為97.2%，陰性預(yù)測值為88.2%，陽性似然比(+LR)27.82，陰性似然比(-LR)0.11；GP73診斷HCC的截?cái)嘀?77.68 ng/mL，AUC=0.937，靈敏度為92.31%，特異度為83.87%，陽性預(yù)測值為87.8%，陰性預(yù)測值為89.7%，+LR：5.72，-LR：0.092。結(jié)論GPC3、GP73在HCC患者中表達(dá)明顯增高，且靈敏度顯著優(yōu)于常規(guī)AFP，GPC3、GP73的特異度與常規(guī)AFP相近，因此GPC3、GP73有望成為一種新的較好、可靠的HCC無創(chuàng)診斷指標(biāo)。

磷酯酰肌醇蛋白聚糖3；高爾基體蛋白73；肝細(xì)胞癌

肝細(xì)胞癌(HCC)在我國發(fā)病率逐年上升，目前常規(guī)甲胎蛋白(AFP)和超聲檢查篩選方法敏感度、特異度均不能令人滿意，很多HCC患者臨床診斷時(shí)已失去有效的治療機(jī)會(huì)。本研究發(fā)現(xiàn)磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高爾基體蛋白73(GP73)在HCC診斷中具有一定應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、一般資料

收集2012年12月至2013年12月句容市人民醫(yī)院與南京市第二醫(yī)院就診的39例HCC、31例肝硬化患者資料。70例患者中，男性45例，女性25例；平均年齡分別為HCC組(46.2±10.1) 歲，肝硬化(乙型或丙型肝炎)組(49.2±10.3) 歲。無其他肝炎病毒重疊感染，無自身免疫性肝炎重疊。基線時(shí)收集患者外周血及肝組織，肝硬化的診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》標(biāo)準(zhǔn)[1]，肝癌的診斷參照2011年《原發(fā)性肝癌診斷規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)[2]。

二、本研究設(shè)計(jì)是病例對照研究，遵循赫爾辛基宣言和我國頒布的藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范(GCP)，方案經(jīng)倫理委員會(huì)討論通過后執(zhí)行。

三、觀察項(xiàng)目

血清GPC3、GP73表達(dá)量、外周血PBMC及肝組織中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相對表達(dá)量、肝組織病理及AFP。肝組織來源于外科手術(shù)標(biāo)本或CT引導(dǎo)下1 s快速穿刺標(biāo)本。

四、方法

(一)主要試劑及儀器 Taq購自美國Promega公司；肝功能檢測采用美國貝克曼公司自動(dòng)生化儀；HBV、HCV定量PCR擴(kuò)增儀為Rotor-Gene 6000(澳大利亞Corbett Research公司)，試劑盒為美國Biosourse公司提供；24孔平底培養(yǎng)板(美國Corning公司)； RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FSQ-101(日本Toyobo公司)；熒光定量試劑盒SYBR○RPremix Ex TaqTMII(日本Takara公司)；GPC3、GP73檢測：上海博研生物科技有限公司生產(chǎn)ELISA試劑；HBVM檢測：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb檢測用ELISA法，按美國Abbott試劑盒說明操作；HBV DNA定量：采用Rotor-Gene 6000(澳大利亞Corbett Research公司)，擴(kuò)增儀按試劑盒(美國Promega公司)說明操作。

(二)ELISA法檢測血清GPC3、GP73表達(dá)量操作步驟

準(zhǔn)備試劑，96孔板中加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃ 30 min，洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37℃ 30 min，洗板5次，依次加入顯色液A、B，37℃顯色10 min后加入終止液，15 min之內(nèi)讀取OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)(5倍)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)(5倍)，即為樣品的實(shí)際濃度。

(三)qRT-PCR法檢測外科手術(shù)切除或者肝穿刺肝組織中GPC3 mRNA及GP73 mRNA表達(dá)操作步驟

①肝組織細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(美國Invitrogen)，加青霉素、鏈霉素使之終濃度分別為100 U/mL，置于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。用Trizol試劑(美國Invitrogen)收集細(xì)胞后，利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA和DNA；組織內(nèi)總RNA和基因組DNA的提取也按照Trizol試劑的說明操作。濃度用NanoDrop1000 (美國Nanodrop)檢測。隨后根據(jù)高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems)說明將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。② GP73與β-actin及GPC3與β-actin兩種RT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、上游引物(10 μmol/L)1.6 μL、下游引物(10 μmol/L) 1.6 μL、 模板2 μL、ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)條件 ：95 ℃ 3 min；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 7 min，40 個(gè)循環(huán)，退火時(shí)采集熒光。GP73 上游引物 ：5′ -CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3′ ，下游引物 ：5′-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3′；GPC3上游引物：5′ -TGGACATCAATGAGTGCCTCC -3′，下游引物：5′-CCACATTCTGGTGAGCATTCG-3′；β-actin 上游引物 ：5′-CGTACACTGGCATCGTGAT-3′ ，下游引物 ：5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。GP73及GPC3 mRNA表達(dá)水平通過ABI 7500 Real-time PCR System(美國Applied Biosystems)進(jìn)行檢測。

(四)qRT-PCR法檢測外周血PBMC內(nèi)GPC3 mRNA及GP73 mRNA表達(dá)操作步驟

①外周血PBMC分離：取2 mL全血置于 EDTA 抗凝劑試管中，加入等體積PBS溶液混勻。另準(zhǔn)備1個(gè)干凈的10 mL離心管，加入4 mL人淋巴細(xì)胞分離液，在人淋巴細(xì)胞分離液面上1 cm處沿管壁緩慢加入血液與PBS混合液。切記勿破壞液體界面。1500 rpm離心 20 min后，小心吸取云霧狀白膜層，即為PBMC。②將PBMC抽提總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增。GPC3、GP73及β-actin 熒光定量PCR引物由本研究室設(shè)計(jì)，上海生物工程有限公司合成。GPC3：For：GCCCATTCT-CAACAACGC，Rev：CACTTTCAAACCCTTCCTCAT;GP73: For：CAGCGCTGATTTTGAGATGA，Rev：ATGATCCGTGTCTGGAGGTC;β-actin：For：CG-TACCACTGGCATCGTGAT，Rev：GTGTTGGC-GTACAGGTCTTTG。GP73及GPC3 mRNA表達(dá)水平通過ABI 7500 Real-time PCR System(美國Applied Biosystems)進(jìn)行檢測。

(五) AFP測定

采用Centaur XP化學(xué)發(fā)光法分析儀及其配套試劑(德國SIEMENS公司)檢測患者血清AFP濃度，按照儀器和試劑說明書進(jìn)行操作。

(六)MR或CT

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、入選病例基線情況

由表1可見，70例入選本研究的HCC與肝硬化患者在性別、年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，兩組病例的臨床特征具有可比性。

表1 入選病例基線情況

二、兩組病例GPC3、GP73的測量值比較

HCC組：GPC3(15.8±3.86) μg/L、GP73(107.46±29.5) ng/L，肝硬化組：GPC3(7.51±1.38) μg/mL、GP73(65.09±17.23) ng/mL。由此可見，HCC組GPC3、GP73的測量值顯著高于肝硬化組測量值(P<0.001)。GPC3、GP73測量值增高患者中GPC3>9.3 μg/L、GP73>77.68 ng/mL患者發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)更高達(dá)92.31%。

三、GPC3與GP73診斷HCC的ROC曲線分析

由圖1、圖2可見，GPC3判斷的截?cái)嘀?9.3 μg/L，AUC=0.956，靈敏度為89.74%，特異度為96.77%，陽性預(yù)測值為97.2%，陰性預(yù)測值為88.2%，+LR為27.82、-LR為0.11；GP73判斷的截?cái)嘀?77.68 ng/mL，AUC=0.937，靈敏度為92.31%，特異度為83.87%，陽性預(yù)測值為87.8%，陰性預(yù)測值為89.7%，+LR為5.72、-LR為0.092。

（一）科學(xué)規(guī)劃產(chǎn)業(yè)開發(fā)和布局，選址中歐班列（重慶）起點(diǎn)-沙坪壩區(qū)土主、回龍壩等鄉(xiāng)鎮(zhèn)區(qū)域，打造“一帶一路”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)國際合作示范區(qū)。從水陸空三大國際樞紐片區(qū)來看，江北空港、果園港片區(qū)均在兩江新區(qū)范圍內(nèi)，以發(fā)展先進(jìn)制造業(yè)和國際物流的產(chǎn)業(yè)載體帶動(dòng)毗鄰村鎮(zhèn)融入國際化，唯有中歐班列（重慶）起點(diǎn)片區(qū)缺乏相應(yīng)能級規(guī)格的國際合作示范園區(qū)。根據(jù)錯(cuò)位發(fā)展原則，建議在中歐班列（重慶）起點(diǎn)附近的土主、回龍壩等村鎮(zhèn)區(qū)域選址，集中連片規(guī)劃發(fā)展“‘一帶一路’現(xiàn)代農(nóng)業(yè)國際合作示范區(qū)”。

圖1 GPC3篩檢HCC的ROC曲線

圖2 GP73篩檢HCC的 ROC曲線

四、兩條ROC曲線比較

由圖3可見，GPC3與GP73的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；說明兩個(gè)指標(biāo)在早期HCC的預(yù)測方面一致。

圖3 GPC3與GP73篩檢HCC的ROC曲線比較

五、qRT-PCR 法檢測PBMC中GPC3、GP73 mRNA表達(dá)水平

兩組病例PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表達(dá)量分別為HCC組：GPC3 (16.94±8.67) μg/L、GP73(12.51±2.97) ng/mL，肝硬化組：GPC3 (15.63±7.35) μg/L、GP73( 14.25±3.67) ng/mL。HCC組GPC3、GP73 mRNA的表達(dá)量與肝硬化組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖4)；推測可能是GPC3、GP73主要是肝癌細(xì)胞分泌后釋放入血，所以PBMC中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；具體原因有待進(jìn)一步研究。

六、ELISA法檢測血清中GPC3、GP73含量的相關(guān)性分析

將肝硬化組血清中GPC3、GP73含量做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，兩個(gè)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)r=0.6694，具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.0001)；HCC組血清中兩個(gè)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)r=0.4645，也具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(P=0.0029)(見圖5)。

七、GPC3、GP73的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值與MR/CT比較

GPC3的靈敏度為89.74%，特異度為96.77%，陽性預(yù)測值為97.2%，陰性預(yù)測值為88.2%；GP73的靈敏度為92.31%，特異度為83.87%，陽性預(yù)測值為87.8%，陰性預(yù)測值為89.7%；MR/CT的靈敏度為70%，特異度為98%，陽性預(yù)測值為92.3%，陰性預(yù)測值為96.3%。由此可見，GPC3、GP73的靈敏度明顯較MR/CT高(P<0.05)，特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

八、兩組病例外周血GPC3、GP73濃度值及組織mRNA表達(dá)相對值

HCC組：GPC3(16.81±0.56) μg/L、GP73(115.92±7.01) ng/mL；GPC3 mRNA(8.91±3.70) μg/L，GP73 mRNA (68.41±32.86) ng/mL。肝硬化組：GPC3(7.41±0.25) μg/L、GP73(64.63±3.07) ng/mL；GPC3 mRNA (3.04±0.58) μg/L、GP73 mRNA (2.32±0.25) ng/mL。外周血中HCC組GPC3、GP73的測量值顯著高于肝硬化組測量值(P<0.001)；組織中HCC組GPC3 mRNA、GP73 mRNA表達(dá)高于肝硬化組(見表2)。

九、GPC3、GP73與AFP的靈敏度及特異度比較

GPC3靈敏度20/23=86.96%(95%CI75.8～97.7)，特異度28/29=96.55%(95%CI83.3～99.9), 陽性預(yù)測值20/21=95.24%(95%CI85.2～99.9)；GP73靈敏度21/23=91.31%(95%CI79.1～

圖4 qRT-PCR 法檢測PBMC中GPC3、GP73 mRNA的含量

圖5 ELISA法檢測血清中GPC3、GP73含量的相關(guān)性

表2 HCC組及肝硬化組外周血GPC3、GP73濃度及組織中mRNA表達(dá)值

98.4)，特異度25/29=86.21%(95%CI66.3～94.5)，陽性預(yù)測值21/25=84.01%(95%CI73.8～95.9)。另外通過查閱文獻(xiàn)，將AFP的截?cái)嘀刀?0 ng/mL[3]，52例患者血AFP值從住院期間化驗(yàn)結(jié)果中獲得(表2)：靈敏度為14/23=60.87%(95%CI40～65),特異度24/29=82.76% (95%CI76～91)，陽性預(yù)測值14/19=73.68 %(95%CI9～32)。

十、GPC3、GP73 表達(dá)及其病理學(xué)特征

HCC組患者中外周血GPC3、GP73濃度及組織mRNA表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤大小及肝癌臨床分期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而HCC組患者GPC3表達(dá)與病理分級間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)，病理分級為3級的HCC組患者GPC3低于1～2級患者。

表3 HCC患者血清GPC3、GP73及肝組織相應(yīng)mRNA表達(dá)水平的臨床病理學(xué)特征分析

討 論

目前HCC發(fā)病率極高，而且在全世界范圍內(nèi)逐漸上升。HCC患者5年生存率不到10%，是惡性程度最高的腫瘤之一。慢性肝炎病毒感染導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化是HCC最主要的危險(xiǎn)因素。很多HCC患者臨床診斷時(shí)已失去有效的治療機(jī)會(huì)；如果能夠在早期診斷，包括外科手術(shù)切除腫瘤、肝移植、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)、射頻消融術(shù)(RFA)等綜合性治療方法能取得相對較好的效果[4]。2005年，美國肝病學(xué)會(huì)(AASLD)提出對于HCC高?；颊叩谋O(jiān)測方案，每6個(gè)月進(jìn)行血清AFP和超聲檢查[5]。近年全世界廣泛應(yīng)用MR/CT，有望比超聲檢查提高靈敏度及特異度。由于檢查的代價(jià)及設(shè)備的要求使廣大基層難以開展。因此，各國學(xué)者從未停止尋找新的更好的HCC腫瘤標(biāo)志物。理想的腫瘤標(biāo)志物需要較高的特異度，能夠?qū)CC與肝硬化、肝炎、肝再生結(jié)節(jié)區(qū)分開來；同時(shí)還需較高的敏感度，能夠在HCC早期診斷，且有易檢測、可重復(fù)、侵入少的特點(diǎn)。新的基因和蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)展對篩選新的腫瘤標(biāo)志物提供了很大的幫助。然而，腫瘤標(biāo)志物從實(shí)驗(yàn)室到臨床應(yīng)用，還有一個(gè)很長的過程。美國癌癥研究所認(rèn)為一個(gè)腫瘤標(biāo)志物臨床應(yīng)用前必須經(jīng)歷以下5個(gè)階段：即臨床前研究、臨床驗(yàn)證、縱向回顧研究、預(yù)期檢測、腫瘤控制研究[6]。本課題組研究的兩種HCC的血清標(biāo)志物在國內(nèi)外研究概況及水平：(1)GPC3是一種于1995年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外糖蛋白，屬于硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)家族的一員，是一種腫瘤抑制物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[7]。功能：正常人組織中表達(dá)極少，在正常肝組織中不表達(dá)，可能在肝臟功能中發(fā)揮著重要作用[8]。結(jié)構(gòu)：GPC3基因定位在X染色體上，編碼產(chǎn)物為一具有580個(gè)氨基酸，大小為66 kD左右的HSPG。通常GPC3通過C端的糖磷脂酞肌醇連接在細(xì)胞膜表面，A358和A359之間的位點(diǎn)被切開可獲得分泌型的可溶性蛋白形式。檢測資料：用RT-PCR檢測mRNA水平上的表達(dá)或者用Western blot從蛋白水平上檢測[9]，ELISA法也可以檢測[10]。(2)GP73是 2000 年，由 Kladney等[11]發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高爾基體二型跨膜蛋白，GOLPH2 蛋白定位于細(xì)胞高爾基體，且主要位于高爾基體膜順面(Trans)；但同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，GOLPH2 可以通過內(nèi)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，并剪切分泌到細(xì)胞外基質(zhì)；而且有可能存在內(nèi)化，從細(xì)胞表面再次回到細(xì)胞高爾基體的過程[12-13]。結(jié)構(gòu)：體外轉(zhuǎn)譯研究表明，其是一個(gè)完整的膜蛋白分子，該基因在體內(nèi)正常翻譯的蛋白在 SDS-PAGE 電泳上表現(xiàn)的分子量為 73 kD；免疫定位研究表明，該蛋白定位在高爾基體上，所以 GOLPH2 最初定名為 GP73。功能：GOLPH2 最先是從新城疫病毒感染研究發(fā)現(xiàn)，始終與疾病存在緊密聯(lián)系，尤其與肝病關(guān)聯(lián)。Kladney等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GOLPH2 與肝臟腺病毒感染相關(guān)，肝細(xì)胞感染腺病毒后，細(xì)胞內(nèi) GOLPH2 表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)腺病毒缺失 E1A 的 CTBP 結(jié)構(gòu)域后，上調(diào)效果消失；GP73表達(dá)與肝纖維化的輕重程度成正相關(guān)(肝纖維化程度越重，GP73越高)，患者從肝硬化發(fā)展成HCC時(shí)GP73表達(dá)達(dá)到高峰，GP73在HCC患者表達(dá)與AFP無明顯的相關(guān)性(能夠篩選出AFP假陰性的肝癌)。所以GP73高表達(dá)可能與HCC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[14]。檢測資料：用RT-PCR檢測mRNA水平上表達(dá)或者用Western blot從蛋白水平上檢測，ELISA法也可以檢測。本研究采用ELISA法對患者血清中GPC3和GP73 的蛋白水平進(jìn)行檢測，同時(shí)利用qRT-PCR法對相同患者PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA水平進(jìn)行檢測。ELISA法結(jié)果顯示，HCC組血清中GPC3和GP73的含量顯著高于肝硬化組；GPC3、GP73判斷的靈敏度，特異度，陽性預(yù)測值，陰性預(yù)測值,約登指數(shù),AUC，似然比(+LR，-LR)均很高；且無論在HCC組還是在肝硬化組，GPC3和GP73兩個(gè)指標(biāo)之間均具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，并且GPC3與GP73的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明兩個(gè)指標(biāo)在早期HCC的預(yù)測方面一致；提示可以根據(jù)GPC3和GP73的水平作為診斷HCC的臨床指標(biāo)。qRT-PCR法結(jié)果顯示，根據(jù)PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的表達(dá)水平，無法區(qū)分HCC組和肝硬化組；比國際公認(rèn)的AFP靈敏度顯著更高，特異度與常規(guī)的AFP相近；也比國際公認(rèn)的MR/CT靈敏度顯著更高，特異度與常規(guī)的MR/CT相近。qRT-PCR法所需的檢測標(biāo)本PBMC較難獲得，整個(gè)操作過程技術(shù)條件要求高，費(fèi)用昂貴，MR/CT對基層醫(yī)療單位而言設(shè)備難以達(dá)到，因此均不適宜基層醫(yī)療單位開展。相比較而言，ELISA方法簡單，所需檢測標(biāo)本血清比較容易獲得，患者所付費(fèi)用明顯降低，同時(shí)對基層醫(yī)療單位設(shè)備的要求可操作性也低。因此GPC3 、GP73有望成為一種新的較好、可靠的HCC無創(chuàng)診斷指標(biāo)。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)．肝臟, 2011,16:2-16.

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(本文編輯：易玲)

江蘇省衛(wèi)生廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(YG201311)；江蘇大學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目(JLY20120103)

212400 江蘇 句容市人民醫(yī)院感染科(汪順才，馬久明，周華，虞臘青，經(jīng)繼生)；江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院(馬潔)； 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院(朱夢琪)；南京市第二醫(yī)院(楊永峰)

經(jīng)繼生，Email：jrjjs2008@sina.com

2016-07-02)